补肾活血颗粒指纹图谱试验研究

李静，张文理 ，张伟，王冰，王伟

（1 青岛市中医医院，山东 青岛；2 山东中医药大学，山东 济南；3 青岛市中心医院，山东 青岛）

0 引言

为提高药品质量，保证用药疗效，对补肾活血颗粒进行高效液相特征指纹图谱试验研究，并对其特征指纹图谱中可辨析的19 个共有峰中的5 个色谱峰进行了成分标定和药材来源初步归属，为全面控制该制成品制剂质量提供了依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱仪，包括G1322A 型在线脱气机，G1313A 型自动进样器，G1315A 型DAD 检测器，G1316A 型柱温箱（美国Agilent 公司）；CPA225D 型十万分之一电子分子天平（德国Sartorius 有限公司）；Agilent HCC18 色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)。

1.2 试药

丹参酮ⅡA 对照品（批号：110766-201520）；芍药苷（批号：110736-201438）；马钱苷（批号：11640-201606）；补骨脂素（批号：110739-201617）；党参炔苷（111732-201206）；梓醇（110808-201210）；异补骨脂素（批号：0738-201313）；丹参素钠（110855-201412）；齐墩果酸（批号：0709-9803）均购自中国食品药品检定研究院。

13 批次补肾活血颗粒批号为S1(160722)、S2(160723)、S3(160724)、S4(160725)、S5(160726),S6(160728),S7(160729)、S8(160730) 、S9(160731)、S10(160801) 、S11(160802)、S12(160803)、S13(160804)，甲醇、乙腈为色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

黑顺片（产地：陕西 批号：150901）；酒山茱萸（产地：浙江 批号：201511010）炒葶苈子（产地：河北 批号：201505010）；盐补骨脂（产地：江苏 批号：151002）； 熟地黄（产地：201510062 批号：201510062）； 赤芍（产地：内蒙古 批号：201511035）；大枣（产地：河北 批号：150901）；党参（产地：甘肃 批号：160116）；黄芪（产地：内蒙古 批号：151016）；丹参（产地：山东 批号：151112）。

处方药材来自青岛市海慈医疗集团药剂科中草药房（浙江安国市平安药业有限公司），经本院张伟主任中药师鉴定符合2015 年版《中国药典》相关项下要求。

2 试验部分

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent HC-C18 (4.6×250 mm，5 μm)；流 动相：乙腈(A)-水(B)，按表1 程序进行梯度洗脱；流速：0.8 ml/min；检测波长：230 nm；柱温：25 ℃；进样体积：6 μl。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取丹参酮ⅡA、芍药苷、马钱苷、补骨脂素、异补骨脂素0.5 mg，置10 ml 容量瓶中，加适量甲醇超声处理40min 使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品1 袋（约10 g），研细，精密称取约1.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入90% 甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理40min，放冷，再称定，用90%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 十味药材溶液的制备

分别各取黑顺片、酒山茱萸、炒葶苈子、盐补骨脂、赤芍、熟地黄、大枣、党参、黄芪、丹参适量，粉碎，置于具塞锥形瓶中，分别加90%甲醇40 ml，超声处理40min，滤过，取续滤液分别作为每味药材的提取液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取S3 号样品供试品溶液，连续进样6 次，以9 号峰（芍药苷峰）作参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果，各共有峰相对保留时间 RSD 在0.33%-1.69%之间，相对峰面积RSD 在1.03%-3.51%之间，显示该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取S3 号样品9 份，制备成供试品溶液进行试验。以9 号峰（芍药苷峰）作为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD 为0.41%-1.77%，相对峰面积的RSD 是1.07%- 3.12%，显示方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取S3 号样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定。以9 号峰（芍药苷峰）作为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD 为0.53%-1.66%，相对峰面积的RSD 为1.18%-3.94%，表明供试品在24h 内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 图谱采集

依次精密吸取各供试品溶液、各单一对照品溶液、混合对照品溶液、单味药材溶液各5 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.2 共有峰的标定

按“2.1”项下方法，对13 批补肾活血颗粒样品进行试验，观察所得指纹图谱，选取吸收信号较强、稳定性好、峰形明显的19 个色谱峰，确定为共有峰。其中9 号峰（芍药苷峰S）吸收强，峰面积大，受其他峰干扰少，成分确定，故取其作为补肾活血颗粒指纹图谱的参照峰S。以9 号峰的保留时间和色谱峰面积为1，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.3 共有峰的指认

采用对照品对照法对混合对照品HPLC 图谱共有峰进行指认，以相对保留时间为判断依据，19 个共有峰可以指认5 个成分峰，比对指认出马钱苷、芍药苷、补骨脂素、异补骨脂素、丹参酮ⅡA。

2.4.4 样品相似度评价

采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.130723 版本)，以对照谱图上标示的色谱峰作为匹配点，进行多点校正，并计算结果，13 批补肾活血颗粒指纹图谱的相似度在 0.926-0.971 之间，平均值为0.949，RSD 值为1.65%。

3 讨论

《国家药品标准技术规范》中规定，中药指纹图谱系指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱[1]。

中药质量控制是中药现代化研究的核心问题之一。随着科技的不断发展,中药的质量控制由传统的单凭经验鉴别气味、口感、色泽等逐步发展到薄层、紫外、红外、荧光、色谱等技术的应用。虽然高效液相法得到了广泛的应用,但也局限在单一成分定量上。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品、成品质量的真实性、优良性和稳定性[2]。

（1）本实验对梓醇、丹参素钠、齐墩果酸、党参炔苷也进行了对照品定性研究，但由于其在本流动向下未出峰或与其他重合，因此不能将其作为定性研究对照[3]。

（2）经查阅文献资料，汇总优选出处方中药材的类似流动相以及多数共同的检测波长，在优选波长230 nm 下通过实验，选出各流动相的持续冲柱时间，使之在图谱中出现的色谱峰呈现多样性。

（3）本实验对补肾活血颗粒进行了指纹图谱定性分析方法的初步探索，该方法简单可靠，此方法可以快速检测颗粒中的药材和化学成分，并为之后的指纹图谱定量分析研究打下基础[4-8]。