锌离子螯合剂对抗NMDA受体脑炎 致海马神经元损伤的保护作用

李振宏

摘要：目的  研究鋅离子螯合剂（TPEN）干预抗抗N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体脑炎诱导的神经元损伤的作用及机制，为治疗抗NMDA受体脑炎提供新的研究靶点。方法  选取成年Wistar大鼠40只，随机分为TPEN组、ZnSO4组、对照组和正常组4组，各10只。建立抗NMDA受体脑炎诱导的体外神经元细胞损伤模型，应用台盼蓝染色、细胞免疫组织化学、TUNEL神经元细胞凋亡检测和荧光锌离子探针技术检测锌离子螯合剂干预抗NMDA受体脑炎导致神经元损伤的作用机制。结果  谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度升高而上升（P<0.05）;在谷氨酸浓度为200﹑300﹑400 μmol/L时，神经元凋亡率随着浓度上升而下降（P<0.05）。凋亡后24、48、72 h，TPEN组、ZnSO4组及对照组神经元凋亡率高于正常组，神经元存活率低于正常组，且TPEN组神经元凋亡率低于ZnSO4组及对照组，神经元存活率高于ZnSO4组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;TPEN组、ZnSO4组及对照组Caspase-3阳性率高于正常组，且TPEN组Caspase-3阳性率低于ZnSO4组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;TPEN组锌离子阳性细胞数低于对照组及ZnSO4组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  TPEN干预神经元损伤的机制可能是通过抑制锌离子流向细胞内，促进Caspase-3表达减少，从而减少细胞凋亡的发生。

关键词：锌离子螯合剂;抗NMDA受体脑炎;神经元

中图分类号：R741                                 文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.029

文章编号：1006-1959（2020）08-0092-04

Abstract：Objective  To study the effect and mechanism of zinc ion chelating agent （TPEN） on anti-N-methyl-D-aspartic acid （NMDA） receptor encephalitis-induced neuronal damage， for the treatment of anti-NMDA receptor encephalitis Provide new research targets.Methods  40 adult Wistar rats were selected and randomly divided into 4 groups of TPEN group， ZnSO4 group， control group and normal group， 10 rats each. Establish anti-NMDA receptor encephalitis-induced neuronal cell damage model in vitro， using trypan blue staining， cellular immunohistochemistry， TUNEL neuronal cell apoptosis detection and fluorescent zinc ion probe technology to detect zinc ion chelating agents to interfere with anti-NMDA The mechanism of body encephalitis causing neuron damage.Results  When the glutamate concentration is 100， 200 μmol/L， the apoptosis rate increases with the glutamate concentration （P<0.05）; when the glutamate concentration is 200， 300， 400 μmol / L， the nerve rate of meta-apoptosis decreased with increasing concentration （P<0.05）. At 24， 48， and 72 h after apoptosis， the neuronal apoptosis rate in the TPEN group， ZnSO4 group， and control group was higher than that in the normal group， the neuron survival rate was lower than that in the normal group， and the neuron apoptosis rate in the TPEN group was lower than that in the ZnSO4 group and in the control group， the neuron survival rate was higher than that in the ZnSO4 group and the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; The positive rate of Caspase-3 in TPEN group， ZnSO4 group and control group was higher than that in normal group， and the positive rate of Caspase-3 in TPEN group was lower than that in ZnSO4 group and control group， the difference was statistically significant（P<0.05）; zinc ion positive in TPEN group The number of cells was lower than that in the control group and the ZnSO4 group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion  The mechanism by which TPEN interferes with neuronal damage may be by inhibiting the flow of zinc ions into the cell， promoting the decrease of Caspase-3 expression， and thus reducing the occurrence of apoptosis.

Key words：Zinc ion chelator;Anti-NMDA receptor encephalitis;Neurons

抗N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体脑炎是一种神经系统免疫性疾病，若治疗不及时，会严重地威胁患者生命安全[1]。锌是一种对维持神经细胞正常功能必需的微量元素，生理浓度的锌可维持神经细胞的正常功能，但锌离子在细胞内浓度过高，则会对神经细胞造成损害[2]。有研究表明[3]，锌离子螯合剂（tetrakis pyridylmethyl ethylenedia，TPEN）可以与游离锌离子形成复合物，并且减少神经元细胞对锌离子的摄取，减轻海马神经元的缺血性损伤。本研究通过建立体外神经细胞损伤模型，观察TPEN干预神经元损伤的作用及机制，以期为抗NMDA受体脑炎提供新的研究靶点，现报道如下。

1材料和方法

1.1实验动物  清洁级成年Wistar大鼠40只，2～3月龄，体质量200～250 g，由南昌大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（赣）2015-0001。选择Wistar大鼠培养神经元细胞，随机分为TPEN组、ZnSO4组、对照组和正常组4组，各10只大鼠;同时，每组设立24﹑48和72 h共3个时间点，每个时间点15个标本。

1.2方法

1.2.1細胞培养  选择Wistar大鼠，酒精消毒后，仔细分离出大脑海马，剪碎后，胰蛋白酶浓液消化成小块，胎牛血清终止反应后，调节细胞液浓度为1×105/ml，接种于细胞培养板中。培养10天后，再进行神经元鉴定。

1.2.2神经细胞损伤模型  细胞培养第10天，将细胞分为对照组及不同浓度谷氨酸组，谷氨酸浓度分别为100、200、300、400 μmol/L。对照组加入缓冲液处理，谷氨酸作用于神经元15 min后更换细胞培养液，细胞培养24 h后，进行神经元台盼蓝染色和TUNEL细胞凋亡检测。

1.2.3细胞存活率检测  采用台盼蓝染色神经细胞后，死亡细胞被染成蓝色，存活细胞不着色。随机计数15个细胞视野，计数染成蓝色的神经细胞数及不着色的细胞数，细胞存活率（%）=（存活细胞数/细胞总数）×100%。

1.2.4细胞凋亡率检测  采用TUNEL方法检测细胞凋亡，凋亡细胞被染成深棕色，存活细胞不着色。随机计数15个细胞视野，计数染成深棕色的神经细胞数及不着色的细胞数，细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

1.2.5 Caspase-3基因检测  采用细胞免疫组化法，Caspase-3阳性细胞被染成棕色，随机计数15个视野，计数棕色细胞数和总细胞数，Caspase-3阳性率（%）=（棕色细胞数/细胞总数）×100%。

1.2.6 TPEN干预神经元损伤  把神经细胞分为ZnSO4组﹑TPEN组、对照组和正常组4组，每组分24﹑48和72 h时间点，每个时间点计数15个标本。在加入谷氨酸诱导前1 d，分别加入ZnSO4（50 μmol/L）和TPEN（2.5 μmol/L），对照组中加入相同剂量缓冲液，正常组不加入任何液体。神经细胞培养第10天，将100 μmol/L谷氨酸加入ZnSO4组﹑TPEN组和对照组细胞中，15 min后换回正常神经元培养液，正常组细胞不加入任何液体。继续培养细胞至24﹑48和72 h进行神经元存活率、凋亡率和Caspase-3基因检测。

1.2.7细胞内锌离子含量的检测  神经细胞培养第10天，ZnSO4组﹑TPEN组和对照组中加入100 μmol/L谷氨酸，15 min后换回正常细胞培养液，继续培养细胞至24﹑48和72 h，进行锌离子含量细胞检测。

1.3统计学方法  采用SPSS 19.0统计软件进行统计数据分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1原代神经细胞培养及鉴定  神经元接种在细胞培养瓶后，24 h后可见大多数细胞已经贴壁，少数细胞可见神经轴突长出;48 h后大多数细胞有轴突生长;72 h后神经元胞体变大;细胞培养至第8天，神经元轴突相互连接成网状;培养第10天，进行神经元微管相关蛋-2（MAP2）免疫荧光鉴定，荧光显微镜下可见红色的MAP2阳性神经元胞体及其突起，其中胞体较大，突起细长，见图1。

2.2体外神经元细胞损伤模型  采用台盼蓝染色神经细胞后，24 h后可见肿胀神经元细胞裂解，随着谷氨酸浓度升高，细胞存活率逐渐下降，见图2。采用TUNEL试剂盒检测，24 h后可见凋亡的神经细胞体积变小，神经元胞核固缩，在谷氨酸浓度为100﹑200 μmol/L时，细胞凋亡率随着谷氨酸浓度升高而上升;在谷氨酸浓度为200﹑300﹑400 μmol/L时，神经元凋亡率随着浓度上升而下降，见表1。

2.3 TPEN干预神经元损伤作用

2.3.1神经细胞凋亡率  神经细胞凋亡后，采用TUNE试剂盒进行检测，可见凋亡的神经元胞核呈棕色，神经元体积变小，胞核固缩，见图3。凋亡后24、48、72 h，TPEN组、ZnSO4组及对照组神经元凋亡率高于正常组，且TPEN组神经元凋亡率低于ZnSO4组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3.2细胞存活率  谷氨酸诱导凋亡后，可见神经元细胞肿胀裂解，突起消失，见图4;采用台盼蓝染色神经细胞，随机计数细胞存活率，凋亡后24、48、72 h，TPEN组、ZnSO4组及对照组神经元存活率低于正常组，且TPEN组神经元存活率高于ZnSO4组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.3.3 Caspase-3基因表达  采用细胞免疫组化技术，Caspase-3阳性细胞被染成棕色，突起消失，见图5;凋亡后24、48、72 h，TPEN组、ZnSO4组及对照组Caspase-3阳性率高于正常组，且TPEN组Caspase-3阳性率低于ZnSO4组及对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.3.4细胞内锌离子含量的检测  谷氨酸诱导凋亡后，采用锌离子荧光探针技术，荧光显微镜下可见绿色的锌离子阳性细胞，见图6;随机计数锌离子阳性细胞，结果显示培养后24、48、72 h，TPEN组锌离子阳性细胞数低于对照组及ZnSO4组，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

3讨论

NMDA受体脑炎是一种主要累及大脑边缘系统的免疫性脑炎，可以急性或亚急性起病。NMDA受体是谷氨酸通道受体，当通道异常失活可导致癫痫发作及记忆力下降等症状[4]。Jun JS等[5]研究表明，在反复惊厥发作的大鼠神经细胞中存在锌离子相关基因表达，其中锌转运体ZnT-1、ZnT-2表达量减少，而锌离子流入蛋白Zip-6、Zip-7表达量增加，提示在惊厥过程中存在锌离子向细胞内的流动。当锌离子流向细胞内则会损伤神经细胞，导致神经细胞的凋亡[6]。有研究表明[7]，使用TPEN可以减轻脑卒中后的海马神经元损伤。Pruss H等[8]研究表明，在全脑缺血大鼠模型注射锌离子螯合剂后神经元凋亡率明显降低。TPEN（金属离子螯合物）含有可作为电子供体的吡啶基团，是一种膜渗透性特异性锌螯合剂，可以不受限制地通过神经细胞膜，可以用来螫合神经细胞内锌离子，从而抑制锌离子向细胞内的流动。

本研究在谷氨酸诱导神经元凋亡前，将锌螯合剂TPEN加入到培养好的神经元中，观察TPEN对神经元的保护作用，锌离子荧光探针结果显示，呈现绿色荧光的细胞为锌离子阳性细胞，凋亡后24、48、72 h，TPEN组锌离子阳性细胞率低于ZnSO4组及对照组（P<0.05），提示TPEN可以螯合神经元内的游离锌离子，抑制锌离子流向细胞内，从而降低细胞内的锌离子浓度;TPEN组凋亡基因Caspase-3阳性率低于ZnSO4组及对照组（P<0.05），提示TPEN可抑制Caspase-3的表达;TUNE凋亡检测显示，TPEN组神经元凋亡率低于ZnSO4组及对照组（P<0.05），提示TPEN可能通过抑制Caspase-3的表达，减少神经元的凋亡;台盼蓝染色检测显示，TPEN组神经元存活率高于ZnSO4组及对照组（P<0.05），提示在神经元中加入TPEN后，锌离子阳性神经元数量及神经元凋亡率减少，而神经元存活率升高，说明TPEN对神经元具有保护作用，而其发挥保护作用的机制可能是通过抑制神经元对锌离子的摄取，减少锌离子向神经细胞内流动，抑制凋亡基因Caspase-3的表达，进而减轻对神经元的损伤。

综上所述，锌离子螯合剂对NMDA受体脑炎导致的神经元损伤有保护作用，可能是通过抑制锌离子流向细胞内，减少细胞凋亡的发生，从而对神经细胞起到保护作用。

参考文献：

[1]Dong Y，Kalueff AV，Song C.N-methyl-d-aspartate receptor-mediated calcium overload and endoplasmic reticulum stress are involved interleukin-induced neuronal apoptosisin rat hippocampus[J].Neuroimmunol，2017，307（15）：7-13.

[2]Sayin U，Hutchinson E，Meyerand ME.Age-dependent long-term structural and functional effects of early-life seizures：Evidence for a hippocampal critical period influencing plasticity in adulthood[J].Neuroscience，2015，288（12）：120-134.

[3]Tian T，Ni H，Sun BL.Neurobehavioral deficits in a rat model of recurrent neonatal seizures are prevented by a ketogenic diet and correlate with hippocampal Zinc/Lipid transporter signals[J].Biol Trace Elem Res，2015，167（11）：251-258.

[4]Kumari K，Sahni N，Kumari V.Anti-N-Methyl-D-Aspartate-Receptor Encephalitisin Young Females[J].Anaesthesiol Reanim，2017，45（6）：377-379.

[5]Jun JS，Seo HG，Lee ST.Botulinum toxin treatment for hypersalivation in anti-NMDA receptor encephalitis[J].Ann Clin Transl Neurol，2017，4（11）：830-834.

[6]Li C，Liu C，Lin F.Anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitisassociated with mediastinal teratoma：a rare case report and literature review[J].Thorac Discovery，2017，9（12）：1118-1121.

[7]Phillips GD，Jones GN，Callaghan M.Hemiataxia：A Novel Presentation of Anti-NMDA Receptor Antibody Mediated Encephalitisin an Adolescent[J].Case Report Psychiatry，2017，69（12）：25-28.

[8]Pruss H，Finke C.N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in herpes simplex encephalitis[J].Ann Neurol，2012，72（2）：902-904.

收稿日期：2020-02-24;修回日期：2020-04-01

編辑/成森