?娄底地区鱼类肠道微生物与酶活性的初步研究?

?吴杰奇 曾发姣 雷平 龚平 胡丹 周映华 曾奥 高书锋

摘 要：研究采用微生物传统选择培养法和比色法对娄底地区的草鱼、鲫鱼、鲢鱼和鳙鱼4种鱼肠道的微生物数量和酶活性进行测定，以期为娄底地区鱼类疾病的防治、微生物添加剂的使用提供资料。结果显示：草鱼肠道中真菌、肠球菌和大肠杆菌数量最多，鲫鱼肠道内的优势菌群为乳酸菌，而鲢鱼和鳙鱼肠道内不存在优势菌群;草鱼肠道内纤维素酶和淀粉酶活性较高，鲫鱼肠道内蛋白酶和脂肪酶活性较高，鲢鱼和鳙鱼肠道酶活性表现中规中矩，纤维素酶和淀粉酶活性低于草鱼，蛋白酶和脂肪酶活性低于鲫鱼。分析认为，在健康状态下，鱼类肠道微生物数量和酶活性与其食性存在一定的对应关系。

关键词：淡水鱼类;肠道微生物;肠道酶活性;娄底

中图分类号：S917.1文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）04-0055-03

Preliminary Study on Intestinal Microbial Population and Enzyme Activity of Fish in

Loudi Area

WU Jie-qi1，ZENG Fa-jiao2，LEI Ping2，GONG Ping2，HU Dan2，ZHOU Ying-hua2，

ZENG Ao2，GAO Shu-feng2

（1. Loudi Institute of Aquatic Sciences， Loudi 417000， PRC; 2. Hunan Institute of Microbiology， Changsha， 410009， PRC）

Abstract： In order to provide the data of intestinal microorganism and enzyme activity for the prevention and control of fish diseases and the use of microbial additives in Loudi area， the microbial quantity and enzyme activity in the intestines of Ctenopharyngodon idellain， Carassius auratus， Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis  in Loudi area were determined by traditional microbial selective culture and colorimetry. The results showed that Ctenopharyngodon idellain had the highest number of fungi， Enterococcus and Escherichia coli in the intestine; the dominant bacterium in Carassius auratus intestines was Lactobacillus， however there were no dominant bacteria in Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis. Ctenopharyngodon idellain intestine had higher cellulase and amylase activities， Carassius auratus intestine had higher protease and lipase activities. In Hypophthalmichthys molitrix and Aristichthys nobilis intestines， cellulase and amylase activities were lower than in Ctenopharyngodon idellain， and protease and lipase activities were lower than in Carassius auratus. Therefore， in a healthy state， there is a corresponding relationship between the number of fish intestinal microorganisms and enzyme activity and food habit of fish.

Key words： freshwater fish; intestinal microorganism; enzyme activity; Loudi

相比哺乳动物而言，鱼类肠道内微生物种类比较简单[1-2]。但是由于鱼类自身生理条件的限制，鱼类肠道发育还不够完全，因此这种情况下，由肠道微生物分泌的各种消化酶以及肠道微生物对鱼类免疫的调节功能就显得尤为重要。肠道正常菌群与鱼体及周围水环境共同构成既相互依赖又相互制约的微生态系统，该系统的平衡是维系鱼类健康的关键。

鱼类肠道微生物受多种因素影響，其中主要因素是鱼的种类及栖息水域，其他因素有饵料、发育阶段、水温及生理状况等[3]。目前，已有较多关于淡水养殖鱼类微生物组成的报道。哺乳动物肠道微生物普遍以双歧杆菌和乳酸杆菌为主，与之不同，鱼类之间的肠道优势菌群表现出较大差异，甚至不同区域同一种鱼的肠道优势菌群也不相同[4-7]。因此，对鱼类肠道微生物的研究应该系统化，或者定性至某一固定的养殖条件中进行。

池塘集约化养殖周期短、产量高，是当前主要的水产养殖模式。但该模式的养殖密度高、用饵用药量大，对水产品安全和周遭环境造成较大负面影响[8]。就目前的情况来看，池塘集约化养殖中鱼类肠道正常菌群与鱼体及周围水环境共同构成的微生态系统已经非常脆弱。因此，对不同环境条件中的鱼类肠道微生物及酶活性进行研究显得非常必要。笔者分析娄底地区几种重要经济鱼类的肠道微生物组成及酶活性，以期为该地区鱼类疾病的防治、微生物添加剂的使用和微生态育种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys nobilis）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鲫（Carassius auratus）4种试验鱼类均采集于娄底市水产科学研究所养殖基地同一养殖池塘。池塘水深2.0 m，面积1.5 hm2。每天用商业鱼饲料（草鱼707系列，海大集团） 投喂2次（8：00和15：00）。鱼样采样时间为2019年6月25日7：00，水温27.8℃，pH值6.95，溶氧为3.35 mg/L。在地拉网渔获物中，每类鱼随机选择3尾规格一致的健康个体进行称重，其中草鱼1.00 kg，鲫鱼0.21 kg，鲢鱼0.45 kg，鳙鱼0.41 kg。随后立即冰浴，并运送回实验室，用丁香酚（1∶10 000） 麻醉，再用无菌水和70%乙醇先后冲洗鱼体表面。最后在无菌操作箱内，无菌采集所有样品前肠段内容物。各品种肠道内容物样品编号分别为鲢LC（LC1～LC3）、鳙YC（YC1～YC3）、草鱼CC（CC1～CC3）、鲫鱼JC（JC1～JC3）。

1.2 微生物选择培养

真菌培养基：孟加拉红琼脂（虎红琼脂）;大肠杆菌：山梨醇麦康凯琼脂（SMAC）;肠球菌：胆汁七叶苷叠氮钠琼脂;乳酸菌：乳酸细菌培养基（MRS）。所有合成培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，按照培养基说明进行制作灭菌。

将取得的肠道内容物摇匀，进行无菌稀释，分别得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀释液，然后选择合适的稀释度，吸取0.1 mL均匀涂布于各选择培养基平板上。大肠杆菌和肠球菌35℃培养24 h后计数，乳酸菌35℃厌氧培养48 h后计数，真菌35℃培养72 h后计数。

1.3 肠道内容物酶活性的测定

准确称取肠道内容物质量，按照1∶9（内容物∶生理盐水）加入预冷生理盐水后冰浴匀浆，然后2 000 r/min离心15 min，收集上清液于4℃保存备用。肠道淀粉酶试剂盒、脂肪酶试剂盒、蛋白酶试剂盒和纤维素酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按照各试剂盒操作说明书进行操作。

1.4 数据分析与统计

试验数据采用SPSS 18.0软件进行分析，结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析判别组间的差异显著程度，显著水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同品种鱼肠道微生物的种类及数量

由表1可知，相较于哺乳动物肠道，鱼类肠道内容物中微生物含量非常的低，各类微生物几乎都比哺乳动物低一个数量级，这可能是鱼类肠道进化未完全以及鱼类是变温动物导致的，微生物在哺乳动物肠道内生长环境明显优于鱼类肠道。从微生物的种类和数量来看，不同鱼类之间微生物也表现出显著的差异。草鱼肠道中数量较多的是真菌、肠球菌和大肠杆菌（P<0.05），它们皆为草鱼肠道的优势菌群;鲫鱼肠道内的优势菌群为乳酸菌（P<0.05），而鲢鱼和鳙鱼肠道内不存在优势菌群（P≥0.05）。从传统的益生菌乳酸菌来看，鲫鱼>鲢鱼>鳙鱼>草鱼，可知杂食性鱼类乳酸菌数量多于滤食性和草食性鱼类;而杂食性鱼类真菌数明显低于草食性和滤食性鱼类。

2.2 不同品种鱼肠道酶的活性

由表2可知，不同的鱼类之间消化酶活性差异非常明显。草鱼的纤维素酶活性最高（P<0.05），肠道内纤维素酶主要由微生物分泌，机体几乎不分泌，因此该结果与草鱼肠道内能够分泌纤维素酶的微生物数量最高的结果相符合。鱼类消化器官能够分泌淀粉酶，各品种鱼类肠道中淀粉酶活性由高到低排列依次为草鱼>鲫鱼>鳙鱼>鲢鱼，草鱼肠道内淀粉酶活性仍是最高（P<0.05）。蛋白酶活性以鲫鱼的最高，其次为鳙鱼和鲢鱼，而草鱼的蛋白酶活性最低。脂肪酶活性同样以鲫鱼的最高，草鱼的肠道脂肪酶活性最低。

3 结论与讨论

鱼类肠道含有大量的微生物和消化酶，这些微生物和酶在鱼类的消化吸收和抵御外来致病菌方面起着重要作用。稳定的肠道微生态环境能够帮助鱼类抵御饵料和水体中病原菌对肠道黏膜表面的不断刺激。鱼类的食性与其肠道酶活性是相对应的，由研究结果可知，草食性鱼类含有相对较高的纤维素酶活性和淀粉酶活性，杂食性鱼类含有相对较高的蛋白酶活性和脂肪酶活性，这与之前学者的研究结果一致[9-11]。而滤食性鱼类肠道的纤维素酶和淀粉酶活性均低于草食性鱼类，蛋白酶和脂肪酶高于草食性鱼类、低于杂食性鱼类。结合肠道微生物培养可知，草食性鱼类肠道中真菌、肠球菌和大肠杆菌数量较多，那么这几类微生物很可能是纤维素酶和淀粉酶的高产菌群。同样，杂食性鱼类乳酸菌含量最高，很可能这种乳酸菌的蛋白酶活性非常高。鲢鱼和鳙鱼都属于滤食性鱼类，从肠道微生物和酶活性结果来看，它们在真菌数、乳酸菌数、纤维素酶和淀粉酶等方面表现出了一定的差异（P<0.05），其他指标均没有明显差异（P≥0.05），由此可知，二者在指标上还是存在一定的相似性。

参考文献：

[1] Mitra A，Mukhopadhyay PK，Homechaudhuris S. Understanding probiotic potentials of Bacills bacterial population isolate from Chiala （osteoglossiformes; notoperidae） by comparing the enzyme activity in vitro[J]. International Journal of Pure and Applied Zoology，2014，2（2）：120-127.

[2] Okadinya M O，Ugoh S C，Solomon J R. Studies on the microbial flora found in the intestine of heteroclarias specie[J]. Academia Arena，2013，5（6）：41-51.

[3] Jiang Y H，Tang L L，Zhang F Y，et al. Identification and characterization of immune-related microRNAs in blunt snout bream，Megalobrama amblycephala[J]. Fish & Shellfish Immunology，2016，49：470-492.

[4] 孙敬锋，贾艳丽. 鱼类肠道菌群与免疫调节研究进展[J]. 水产科技情报，2016，43（2）：96-100.

[5] 张 雯，钟 雷，李南充，等. 微生态制剂对池养建鲤体成分、血清指标、消化酶活性以及肠道菌群组成的影响[J]. 水产科学，2015，34（12）：741-749.

[6] Nilsson J，Backstr?m T，Stien L H，et al. Effects of age and rearing environment on genetic parameters of growth and body weight and heritability of skin pigmentation in Arctic Charr （Salvelinus alpinus L.）[J]. Aquaculture，2016，453：67-72.

[7] 王 纯，倪加加，颜庆云，等. 草鱼与团头鲂肠道菌群结构比较分析[J]. 水生生物学报，2014，38（5）：868-875.

[8] 陈泓宇，闫海亚，赵胤丞，等. 宏基因组学及其在鱼类肠道微生物中的研究进展[J]. 水产科学，2018，37（5）：699-706.

[9] Li W，Zhou X Q，Feng L，et al. Effect of dietary riboflavin on growth，feed utilization，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp （Cyprinus carpio var. Jian）[J]. Aquaculture Nutrition，2010，16（2）：137-143.

[10] Hakim Y，Uni Z，Hulata G，et al. Relationship between intestinal brush border enzymatic activity and growth rate in tilapias fed diets containing 30% or 48% protein[J]. Aquaculture，2006，257（1/2/3/4）：420-428.

[11] Chen L，Feng L，Jiang W D，et al. Dietary riboflavin deficiency decreases immunity and antioxidant capacity，and changes tight junction proteins and related signaling molecules mRNA expression in the gills of young grass carp （Ctenopharyngodon idella）[J]. Fish&Shellfish Immunology，2015，45（2）：307-320.

（責任编辑：成 平）