顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）技术分析浓香型竹酒中香气成分

李 涛， 司梦鑫， 李 冲， 朱洪德， 邓贤彬， 朱天虎

（1.四川大学 华西药学院，四川 成都610041； 2.四川活之酿酿酒公社有限公司，四川 泸州646608）

竹为禾本科（Poaceae）竹亚科（Bambusoideae）植物，我国竹类资源极为丰富，有37 属500 余种，有“竹子王国”的美誉，竹类植物的面积、蓄积量和年产竹材量均占世界1／3 左右［1］.

四川省拥有丰富的竹类资源，尤其四川省泸州市是著名的“川南竹乡”，是我国主要竹产区之一［2］.竹类植物的药用历史悠久，竹茎和竹叶中含有黄酮及其苷类、酚酸类、多糖类、氨基酸和肽类、蒽醌类、萜类和内酯类等活性成分［3］，以及以醛、醇为主的芳香成分等，竹叶、竹茹、竹沥、竹黄和竹笋等均是传统中药，具有极高的药用和保健价值.中国白酒有12 种香型，其中浓香型白酒占全国白酒产量的60% ～70%［4］，四川省泸州市是浓香型白酒的主要产地之一.浓香型竹酒（活竹酒和原竹酒）是采用四川省泸州市丰富的竹类植物品种代替糠壳作为酿酒蓬松物发酵制成，活竹酒还需在生长活竹茎中浸泡活化后，制成的绿色、生态和健康的新型酒类饮品.

酿酒的原料、曲种和生产工艺等与白酒的风味特征、香味成分等方面密切相关，香气成分或挥发性成分反映了酒的整体组成，是评价白酒品质的重要指标.因此，研究不同生产工艺的竹酒香气成分，对于评价竹酒产品质量，提升竹酒品质具有重要意义.

目前，挥发性成分的提取方法主要有蒸馏萃取法、液-液萃取法、静态顶空提取法、动态顶空提取法和超临界流体萃取法等.但这些方法均存在一定的缺陷，如液-液萃取法需要大量有机溶剂，耗时且易导致目标物质的损失；静态顶空法易产生过多的蒸汽，影响色谱柱的分离效能［5］.而固相微萃取（SPME）技术具有操作简单、萃取迅速、无需溶剂、可自动化、功能多样、设备低廉、可在线和活体取样，而且可在分析系统直接脱附的优点［6］，已广泛用于挥发性和半挥发性样品的处理和分析.

目前，对于新型酒类饮品的研究，果酒是国内外研究的热点，而对竹酒的研究报道较少，未见对竹酒香气成分的研究报道.本课题组采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术（HS -SPME-GC-MS）对不同生产工艺酿造而成的2 种浓香型竹酒（活竹酒和原竹酒）的香气成分进行分析，并结合嗅觉阈值确定不同香气成分的相对气味活度值（ROAV），评价挥发性成分对新型酒类竹酒总体风味的贡献，确定竹酒的关键风味物质.

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 GC-MS -QP 2010 Plus型气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；萃取纤维头50／30 μm DVB／CAR／PDMS，二乙烯基苯／羧基／聚二甲基硅氧烷，Restek 低流失气相色谱毛细管柱，5%二苯基／95%二甲基聚硅氧烷交联，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm（美国Supelco 公司）；手动固相微萃取装置.活竹酒和原竹酒（四川省泸州市四川活之酿酿酒公社有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 GC-MS条件 气相色谱（GC）分析条件：5%二苯基／95%二甲基聚硅氧烷交联，30 m ×0.25 mm×0.25 μm色谱柱；分流进样，分流比为3；溶剂延迟0.10 min；载气为高纯氦气（99.999%），流速为1 mL／min；进样口温度270 ℃；柱温40 ℃（2 min）.程序升温：以10 ℃／min速率升温至80 ℃保留2 min，以5 ℃／min 速率升温至180 ℃保留5 min，最后以10 ℃／min 速率升温至280 ℃保留2 min；柱前压为49.5 kPa，柱流量为1.00 mL／min.

质谱（MS）分析条件：离子源温度200 ℃；接口温度220 ℃；质量扫描范围33 ～500 m／z.

香气成分的提取：将8 mL 酒液置于20 mL 顶空进样瓶中（装液率为40%），插入老化的50／30 μm DVB／CAR／PDMS 纤维头，60 ℃顶空中恒温萃取50 min 后取出，立即插入气相色谱仪进样口（温度270 ℃）中，热解析1 min，同时启动GC -MS仪进行分析.

1.2.2 挥发性成分的分析 利用计算机对采集到的质谱扫描图谱进行检索，以人工解析进行辅助，与NIST08. LIB 谱库进行对照匹配鉴定，并采用峰面积归一法计算各挥发性成分的相对质量分数.

1.2.3 主体香气成分分析 定义气味活度值（OAV）为嗅感物质的绝对浓度（C）与其感觉阈值（T）之比，用来反映香气成分对整体香气的贡献大小.但是对一包含复杂化合物的样品进行逐一绝对定量不仅工作量繁重且成本高，因此，采用相对气味活度值（ROAV）来衡量某一香气成分对整体香气成分的贡献［7］.ROAV计算公式如下：

Ci%、Ti分别样品中为某一香气成分的相对质量分数和嗅觉阈值，Cs%和Ts分别为样品中相对质量分数最大的组分相对质量分数和嗅觉阈值.

2 结果与分析

2.1 竹酒的挥发性风味成分分析 活竹酒和原竹酒经过顶空固相微萃取结合GC -MS 分析后得到的活竹酒、原竹酒挥发性成分的总离子流图（图1（a）和图1（b））.从色谱图中可见，活竹酒和原竹酒除部分成分的相对峰面积上有差异外，原竹酒在更多的位置出峰，表明原竹酒含有更多的挥发性成分，其化学成分分析结果见表1.从表1 可见，2 种竹酒中共检测出105 种挥发性成分，其中酯类56种，醇类9 种，醛类16 种，酮类7 种，烯酸类3 种，烷烃类8 种，其他类6 种.

活竹酒中共检测出挥发性成分64 种，其中酯类的质量分数为82.87%（41 种），醇类的质量分数为15.05%（6 种），醛类的质量分数为1. 05%（8种），酮类的质量分数为0.36%（3 种），烷烃类的质量分数为0. 28%（3 种），其他类的质量分数为0.18%（3 种），未检测出烯酸类.

原竹酒中共检测出挥发性成分71 种，其中酯类的质量分数为80.09%（35 种），醇类的质量分数为13.83%（8 种），醛类的质量分数为2.78%（12 种），酮类的质量分数为0.17%（4 种），烯酸类的质量分数为0.22%（4 种），烷烃类的质量分数为2.98%（5种），其他类的质量分数为0.09%（3种）.

图1 活竹酒（a）和原竹酒（b）的HS-SPME-GC-MS挥发性成分总离子流图Fig. 1 Total ion flow chromatogram of volatile components in living bamboo wine（a）and raw bamboo wine（b）by HS-SPME-GC-MS

表1 活竹酒和原竹酒挥发性成分Tab. 1 Volatile components of living bamboo wine and raw bamboo wine

表1（续）

表1（续）

表1（续）

2.1.1 酯类香气成分分析 对2 种竹酒来说，在所有的挥发性化学成分中，酯类物质的相对质量分数均在80%以上，在2 种酒样中含量高的共有成分为己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和庚酸乙酯，这些酯类都具有令人愉快的花、果香气，构成了竹酒的主体香气特征.酯类中的己酸乙酯是2 种酒样中相对质量分数最高的挥发性成分（活竹酒为69.19%，原竹酒为55.5%），己酸乙酯具有浓厚的果香、青苹果香，符合浓香型白酒国家标准中对其香气的规定：以己酸乙酯为主体的复合香气［8］.

活竹酒和原竹酒的生产工艺并未改变原有白酒的香气类型，保留了浓香型白酒的特征香气，但是活竹酒经过楠竹灌注生长发酵后成为了更具有代表性的浓香型竹酒.辛酸乙酯和乙酸乙酯在2 种竹酒中含量相似且较高（辛酸乙酯在活竹酒为4.90%，原竹酒为5.25%；乙酸乙酯在活竹酒中为3.13%，在原竹酒中为2.88%），辛酸乙酯有着令人愉悦的花果香气、白兰地酒香，乙酸乙酯有着醚香、带果香的酒香，这2 种酯类对竹酒的主体香气和风味具有重要影响.丁酸乙酯具有菠萝香味，丁酸乙酯在2 种竹酒中的含量也较高（活竹酒为4.11%，原竹酒为1.77%），但丁酸乙酯在活竹酒中含量明显增高.癸酸乙酯具有椰子香型香气，在活竹酒中的相对质量分数为0.72%，在原竹酒中的相对质量分数为4.24%，其相对质量分数有明显差异.

活竹酒为原竹酒的酒液灌注于楠竹竹茎中随竹子生长而成，竹茎可认为是天然的发酵容器，酒液在竹茎中又经过了一次发酵过程.酯类，尤其是乙酸酯类在发酵过程中又发生了氧化、还原、酯化等一系列复杂的化学反应，形成了其他的高级酯或其他更加稳定的香味物质，使酒液的香气物质更加持久，不易挥发［9］.

结果表明，竹茎生长发酵的过程使活竹酒的酯类物质不仅在种类上比原竹酒多，而且其相对质量分数（82.87%）也比原竹酒高，是形成2 种竹酒主体香气特征差异的重要因素.

2.1.2 醇类香气成分分析 醇类是白酒的主要助香成分，是香与味的过渡桥梁，起到一个协调作用.在2 种竹酒醇类物质中，除大部分为乙醇外，2 种竹酒中均检测出正己醇、正丁醇、正辛醇和2 -乙基己醇，这些成分大多具有青草香和花香的特征香气.

一般称具有3 个碳以上的醇类化合物为高级醇，包括正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、正戊醇和异戊醇等，杂醇油为这些高级醇组成的混合体.适量的高级醇给人醇厚、柔和、圆润协调的感觉，而过量的杂醇油则会给酒液带来苦涩味［10］.结果表明，原竹酒中的正戊醇（0.57%）、正丁醇（0.15%）等杂醇油的相对质量分数较高，会使原竹酒稍带苦味.而竹茎生长发酵的过程使活竹酒中杂醇油的含量降低.

2.1.3 醛酮类香气成分分析 醛酮类挥发性物质大多具有果香、花香等香气，使酒液的香味更加令人愉悦.2 种竹酒中共有的醛酮类成分较少，醛类共有成分有壬醛、苯甲醛和癸醛，酮类无共有成分.活竹酒中醛类挥发性物质含量最高的为3 -羟基丁醛，酮类为2 -壬酮；原竹酒中醛类挥发性成分最高的为己醛二乙缩醛，酮类为（Z）-氧代环十七碳-8 -烯-2 -酮.

除此以外，活竹酒中还含有糠醛（0.16%），糠醛被认为是区分酒的香型的重要物质，在酱香型白酒中含量最高，浓香型次之［11］.活竹酒中含有糠醛的原因可能是活竹酒在楠竹竹茎再次经过的发酵过程中醇类氧化所产生的.而以竹类植物代替糠壳，作为蓬松物发酵生产的原竹酒中不含糠醛.

2.1.4 其他类香气成分分析 对于酸类挥发性物质，活竹酒中不含酸类物质，原竹酒含有相对质量分数为0.22%的烯酸类物质.酸类化合物的挥发性较小，呈香性相对较差，对香气的贡献不如酯类化合物，主要起协调口感的作用［9］.

对于烷烃类挥发性物质，活竹酒和原竹酒的共有成分为1，1 -二乙氧基-3 -甲基丁烷，且1，1 -二乙氧基-3 -甲基丁烷也是2 种竹酒中相对质量分数最高的烷烃类挥发性物质，尤其在原竹酒中，其相对质量分数为2.66%（总烷烃含量为2.98%），这可能也是造成2种竹酒香味差别的原因.

2.2 竹酒中关键风味成分分析 竹酒中挥发性成分的相对质量分数并不能全面说明其对整体香气贡献的大小，还需要结合该种挥发性物质的嗅觉阈值进行评价，因此，采用ROAV 值分析各挥发性化学成分对竹酒总体香气的贡献程度.在全部的挥发性组分中，己酸乙酯的相对质量分数最高，嗅觉阈值也相对较小，对竹酒总体香气的贡献最大，所以定义己酸乙酯的xRs＝100，计算其他成分的ROAV值，结果见表2.当xR≥1 时，该化学成分为竹酒的主体风味成分；当0.1≤xR＜1 时，认为该物质对竹酒总体风味具有重要的修饰作用［15-16］.由表2 可知，2 种竹酒中xR≥0.1 的挥发性物质共有14 种，其大部分化学成分为酯类，少数为醛酮类.

表2 活竹酒和原竹酒中挥发性成分的ROAV值Tab. 2 ROAV values of volatile components in living bamboo wine and raw bamboo wine

活竹酒中xR≥1 的挥发性成分有4 种，依次为己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和戊酸乙酯，特别是己酸乙酯和辛酸乙酯，xR＞30，因此，这4 种香气成分构成了活竹酒香气的主要成分，赋予活竹酒浓郁的花果香气.虽然乙酸乙酯和庚酸乙酯的相对质量分数较高，但因其嗅觉阈值很高，使得其ROAV 值很低，说明相对质量分数高的物质对总体香气的贡献并不一定大.活竹酒中0.1≤xR＜1 的挥发性物质依次为己酸丁酯、壬醛、2 -壬酮、异戊酸乙酯和己酸己酯，这5 种物质对活竹酒有重要的修饰作用，赋予活竹酒花草清香的独特香味.

原竹酒中xR≥1 的挥发性物质有5 种，依次为己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯和丁酸乙酯.虽然己酸己酯在原竹酒中相对质量分数仅为0.24%，但因其较低的嗅觉阈值（10 μg／L），具备较高的相对香气活度值，从而对原竹酒整体香气有着重要贡献.原竹酒中0.1≤xR＜1 的挥发性物质有7种，依次为己酸异戊酯、己酸丁酯、3 -苯丙酸乙酯、乙酸异戊酯、壬醛、癸酸乙酯和异戊醛，这些物质的果香、甜香使得原竹酒的主体香气更为丰满浓厚.

3 结论

采用顶空固相微萃取技术对不同生产工艺酿造而成的竹酒的香气成分进行提取，并结合气相色谱-质谱联用技术对挥发性成分进行分析鉴定，结果表明，生产工艺对竹酒的香气成分种类及其相对质量分数有着明显影响.2 种浓香型竹酒（活竹酒和原竹酒）中共检测出105 种挥发性成分，其中活竹酒中共检测出64 种挥发性成分，原竹酒中共检测出71 种挥发性成分，共有成分30 种.2 种竹酒中酯类物质的相对质量分数均在80%以上，含量较高的共有成分为己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯和庚酸乙酯，这些酯类都具有令人愉快的花、果香气，构成了竹酒的主体香气特征.在活竹酒中，酯类成分种类和相对质量分数（82.87%）均大于原竹酒，而醛类、烯酸类、烷烃类和其他类成分的种类和相对质量分数均低于原竹酒，而且竹茎生长发酵的过程使活竹酒中杂醇油的含量降低.

根据不同挥发性化合物的嗅觉阈值和相对质量分数计算ROAV值，利用ROAV值衡量某种挥发性物质对主体香气成分的贡献.结果表明，活竹酒中的己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和戊酸乙酯，特别是己酸乙酯和辛酸乙酯，对活竹酒的主体香气有着非常重要的贡献，形成了活竹酒浓郁的水果香和花香的主体香味；己酸丁酯、壬醛、2 -壬酮、异戊酸乙酯和己酸己酯，这5 种物质对活竹酒的主体香气有重要的修饰作用，赋予活竹酒花草清香的独特香味.原竹酒中己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯和丁酸乙酯具备很高的相对香气活度值，对原竹酒主体香气贡献最为显著；己酸异戊酯、己酸丁酯、3 -苯丙酸乙酯、乙酸异戊酯、壬醛、癸酸乙酯和异戊醛，这些物质使原竹酒的主体香气更为香甜.活竹酒与其它白酒相比较，活竹酒中己酸乙酯的相对质量分数较高［17-18］，占总挥发性成分的60.91%，活竹酒中酯类香气成分种类复杂，更加突出了浓香型白酒的特征，使活竹酒以己酸乙酯为主体的复合香气更加浓郁.

致谢 四川大学泸州市人民政府战略合作专项资金项目（2017CDLZ-S24）对本文给予了资助，谨致谢意.