黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠抗炎因子的调节作用

沈 蒙，王维浩,，康丽君，葛云飞，康子悦，肖金玲，全志刚，王 娟，刘德志，赵姝婷，王金满，曹龙奎,,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319;2.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319;3.黑龙江八一农垦大学 农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心，黑龙江 大庆 163319）

糖尿病是由于胰岛功能部分缺失导致胰岛素（insulin，INS）抵抗或INS分泌不足等症状引起的一种最常见的内分泌疾病，通常伴有细胞因子介导的炎性反应的发生[1]。调查结果显示，现今，全世界已有2亿多人患有糖尿病，到2025年，将有3亿 人患糖尿病[2]，每年导致290多万人死亡，未来30 年这一数字还将上升[3]。临床上缓解糖尿病等症状的磺脲类或双胍类降糖药物，伴有严重的副作用，如恶心、呕吐、食欲下降、腹痛、腹泻、过敏等症状[4]。因此，研究学者从饮食方面着手，探究寻找可以缓解预防糖尿病等症状的天然营养成分，既可以缓解糖尿病等症状，同时又无副作用[5]。

可溶性膳食纤维指不能被人体消化酶消化分解，可溶于热水的非淀粉多糖，如低聚糖、果胶和树胶之类的物质等，可以调节血糖血脂、控制肥胖、抑制肿瘤生长、促进肠道蠕动等[6-8]。研究表明，可溶性瓜尔胶纤维可以改善肥胖C57BL/6小鼠的体质量、血糖水平、INS分泌量。可溶性膳食纤维可以降低糖尿病大鼠餐后血糖浓度，增加INS分泌，改善糖尿病大鼠摄食量和体质量，降低血浆中葡萄糖的浓度[9-11]。黑豆皮是黑豆加工制油过程中的副产物，其价格低廉，且在加工过程中大多被遗弃，少部分被用作饲料，这无疑是一种浪费。黑豆皮中除了有较高含量的色素、油脂和蛋白质外，膳食纤维的含量也较高[12]。

本实验在Ma Mengmei[13]和佐兆杭[14]等的研究基础上，以低剂量链脲佐菌素多次腹腔注射建立2型糖尿病小鼠模型，黑豆皮膳食纤维灌胃剂量为600 mg/kgmb（250 μL/只），研究其对糖尿病和炎症因子水平的影响，为黑豆皮可溶性膳食纤维降血糖功能提供理论依据，同时为黑豆皮副产物开发增加经济价值。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

7 周龄雄性C57/BL6小鼠，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0003。

黑豆皮可溶性膳食纤维粉（纯度为95%以上）国家杂粮技术研究中心;链脲佐菌素 美国Sigma公司;二甲双胍 沈阳市华东试剂厂;小鼠血清INS、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）测试盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析级。饲料配方如表1所示。

表 1 饲料配方Table 1 Diet formulation for mice

1.2 仪器与设备

血糖仪 上海罗氏诊断仪器有限公司;GDE-CSF6膳食纤维测定仪 意大利VELP公司;QBS-200B型气爆工艺试验台 鹤壁正道生物能源公司;MR-96A酶标仪深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;AR2140电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆皮可溶性膳食纤维的制备

制备工艺流程：黑豆皮→蒸汽爆破改性（压强1.0 MPa、时间80 s、水分质量分数15%）→烘干→粉碎（60 目）→耐高温α-淀粉酶处理→中性蛋白酶处理→葡萄糖苷酶处理→过滤→体积分数95%乙醇溶液醇沉→冷冻干燥→粉碎（100 目）→黑豆皮可溶性膳食纤维粉

1.3.2 模型建立

选择7 周龄健康雄性C57/BL6小鼠35 只，体质量（22±2）g。适应性饲养一周后，称量体质量，按体质量随机抽取7 只作为空白组，其余小鼠禁食12 h后，腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kgmb，连续注射5 d后禁食12 h，断尾取血测血糖浓度，当血糖浓度大于11.11 mmol/L时，且陆续出现多饮、多食、多尿症状的小鼠（21 只）为糖尿病模型小鼠[15]，共分为3 组（模型组、阳性药物组和膳食纤维组），每组7 只。空白组及模型组灌胃给予生理盐水（质量分数0.9% NaCl），阳性药物组灌胃二甲双胍（100 mg/kgmb），膳食纤维组灌胃给予（600 mg/kgmb）黑豆皮可溶性膳食纤维溶液，灌胃剂量为250 μL/只，连续灌胃28 d。实验期内，各组小鼠均不限制摄食量与饮水量，每周定时称量小鼠体质量1 次。恒定温度（22±2）℃和相对湿度（55±10）%，昼夜交替12 h/d。动物饲养和处理遵循中国实验动物科学协会实验动物福利和伦理委员会的规定[16]。

1.3.3 动物检测指标测定

1.3.3.1 动物体质量的测定

实验期间观察实验小鼠日常行为状况并记录，末次给药并禁食禁水24 h后，称量并记录小鼠体质量，每周一次[14,17]。

1.3.3.2 动物降血糖指标的测定

眼眶采血法收集血液，12 000 r/min离心10 min，血清于-20 ℃保存，通过相应试剂盒测定INS、TNF-α、IL-4、CRP质量浓度。

1.3.3.3 组织病理学观察

将小鼠的胰腺置于体积分数10%福尔马林溶液中，用乙醇脱水，包埋在石蜡中，切成4 μm切片，并用苏木精-伊红染色，制成切片，在显微镜下观察胰腺的组织形态学结构[17]。

1.4 数据统计与分析

每个实验重复3 次，得到的测试数据采用平均值±标准偏差的形式表示，通过Microsoft Excel 2003和SPSS 20软件进行单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠体质量的影响

图 1 各组小鼠体质量及摄食量的变化Fig. 1 Changes in body mass and food intake of mice in each group

由图1A可知，0 周时，低剂量链脲佐菌素诱导糖尿病模型组明显低于非糖尿病组小鼠体质量。经灌胃给予二甲双胍和可溶性膳食纤维后，1～4 周实验期间内，糖尿病组小鼠体质量持续下降，空白组、阳性药物组和可溶性膳食纤维组小鼠的体质量随着时间的延长，呈现缓慢上升的趋势，相较于0 周时，4 周实验后，分别增长了9.58%、7.84%和6.95%。由图1B可知，0 周时，低剂量链脲佐菌素诱导糖尿病模型组明显高于非糖尿病组小鼠摄食量。经灌胃给予二甲双胍和可溶性膳食纤维后，1～4 周实验期间内，空白组和糖尿病组小鼠摄食量持续上升，阳性药物组和可溶性膳食纤维组小鼠的摄食量随着时间的延长，呈现缓慢下降的趋势。该结果说明黑豆皮可溶性膳食纤维可以有效改善糖尿病小鼠的体质量和摄食量。

2.2 黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠血糖浓度的影响

图 2 各组小鼠空腹血糖浓度变化Fig. 2 Change in blood glucose concentration of mice in each group

由图2可知，在0 周时，空白组与低剂量链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠的空腹血糖浓度有显著性差异（P＜0.05），但糖尿病小鼠各组间空腹血糖浓度均没有显著差异。在1～4 周实验期间的每个时间段，相较于糖尿病模型组，阳性药物组和可溶性膳食纤维组小鼠的空腹血糖浓度显著降低（P＜0.05），但阳性药物组与可溶性膳食纤维组无显著差异。该结果表明，黑豆皮可溶性膳食纤维可显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖浓度。

2.3 黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠INS水平的影响

图 3 各组小鼠INS水平变化Fig. 3 Changes in insulin concentration of mice in each group

由图3可知，与空白组相比，糖尿病模型组小鼠血清INS水平增加了71.28%（P＜0.05）;相较于糖尿病模型组，灌胃给予二甲双胍和可溶性膳食纤维组小鼠血清INS水平分别降低了29.52%（P＜0.05）和11.10%，且可溶性膳食纤维组与阳性药物组小鼠血清INS水平没有显著性差异。说明黑豆皮可溶性膳食纤维可降低糖尿病小鼠的INS水平。据调查研究结果表明，糖尿病INS水平与INS敏感性呈负相关，即当INS水平较低时，INS敏感性较高[18]。富含膳食纤维的谷物、果皮类可以有效地改善糖尿病小鼠INS敏感性[19]。本研究表明，改性黑豆皮SDF可以有效地提高糖尿病小鼠INS敏感性，对II型糖尿病有一定的缓解作用，与上述学者研究结果相一致。

2.4 黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠抗炎因子水平的影响

图 4 各组小鼠血清TNF-α（A）、IL-4（B）和CRP（C）水平的变化Fig. 4 Changes in serum TNF-α (A), IL-4 (B) and CRP (C) levels in mice in each group

由图4可知，糖尿病模型组小鼠相较于空白组，TNF-α和CRP质量浓度显著升高（P＜0.05），IL-4质量浓度显著降低（P＜0.05）。灌胃给予二甲双胍和可溶性膳食纤维组小鼠相较于模型组小鼠的TNF-α质量浓度显著降低（P＜0.05），且阳性药物和可溶性膳食纤维组小鼠的TNF-α质量浓度存在显著差异（P＜0.05）;阳性药物和可溶性膳食纤维组小鼠相较于模型组小鼠的IL-4质量浓度显著提高（P＜0.05），且阳性药物和可溶性膳食纤维组小鼠的TNF-α质量浓度存在显著差异（P＜0.05）;阳性药物和可溶性膳食纤维组小鼠相较于模型组小鼠的CRP质量浓度显著降低（P＜0.05），且阳性药物和可溶性膳食纤维组小鼠的TNF-α质量浓度存在显著差异（P＜0.05）。

2.5 糖尿病小鼠胰腺组织病理学观察与分析结果

图 5 各组小鼠胰腺病理组织切片Fig. 5 Pathological sections of pancreatic tissue of mice in each group

由图5可知，空白组小鼠的胰岛呈椭圆形或近似圆形，面积较大、结构完整，β细胞分布规则、大小均匀、排列完整，细胞质内INS的分泌颗粒多，而且染色较深，未见变性，且胰岛与β细胞边界清晰可见。糖尿病模型组小鼠的胰腺重度萎缩，胰岛面积重度缩小，β细胞严重变性，分布不均匀，排列松散，边界不规则且模糊不清。灌胃给予二甲双胍和可溶性膳食纤维后，糖尿病小鼠的胰腺有明显的改善，胰岛面积显著增大，β细胞的数量显著增多，且细胞水肿变形程度改善，细胞间隙偶有炎性细胞浸润现象，细胞质内的INS分泌颗粒增加，边界较清晰。胰腺病理组织切片结果表明：黑豆皮可溶性膳食纤维对2型糖尿病小鼠的胰岛面积和β细胞有明显的修复能力，进而在一定程度上增加INS的分泌量和糖原合成量，导致机体血糖水平降低。

3 讨 论

膳食纤维作为第七大类营养物质，具有不易被机体消化吸收的特点[20]，摄入可溶性膳食纤维可有效延缓和降低餐后血糖和血清INS水平的升高，维持餐后血糖水平，从而降低机体血液中葡萄糖含量，缓解2型糖尿病等症状[21]。

研究表明，膳食纤维具有调节餐后血糖浓度、升高血清INS水平及维持血糖平衡和稳定等功能[25]，其中可溶性膳食纤维可以改善INS敏感性和葡萄糖耐量，从而预防和治疗2型糖尿病的发生[26]。摄入黏性膳食纤维（主要是可溶性膳食纤维）有助于降低血浆胆固醇水平、调节血糖浓度和使INS水平正常化，因此可以降低糖尿病和心脑血管疾病的发病率[16]。在机体消化道内，可溶性膳食纤维可以减缓餐后血糖及INS反应，从而减少饥饿感[27]，降低体质量及血糖水平。研究表明，TNF-α、IL-4和CRP等非特异性炎症因子与糖尿病的发病机制相关[28-29]。通过研究糖尿病小鼠的空腹血糖浓度和INS水平，发现黑豆皮可溶性膳食纤维具有较好的血糖调节功能。其原因可能为黑豆皮可溶性膳食纤维刺激了残存β细胞分泌INS，提高了末梢组织对INS的敏感性，显著改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，降低了对INS的需求量，有利于糖原的合成作用，从而降低血糖水平和INS水平[22-24]。TNF-α能够介导INS受体使之成为INS受体的抑制剂，因此TNF-α的过度表达会介导INS抵抗[30]。实验结果显示，灌胃给予黑豆皮可溶性膳食纤维组小鼠相较于糖尿病模型组小鼠的TNF-α水平显著降低（P＜0.05）。IL-4是一种人体内多种细胞产生的具广泛生物活性的细胞因子，IL-4是T细胞分泌的细胞因子，参与激活免疫细胞，促进B细胞增殖和分化，在调节体液免疫中起关键性作用[31]。研究结果表明，相较于模型组小鼠，可溶性膳食纤维组小鼠的IL-4水平显著升高（P＜0.05）。CRP是预测糖尿病一个指标，机体组织在损伤和各种炎症刺激后才产生，且CRP的过度表达会导致INS对抗[32]。研究结果表明，相较于模型组小鼠，可溶性膳食纤维组小鼠的CRP质量浓度显著降低（P＜0.05）。上述结果说明黑豆皮可溶性膳食纤维对糖尿病小鼠抗炎因子具有调节作用。在诱导糖尿病模型阶段，低剂量链脲佐菌素多次腹腔注射对小鼠胰岛β细胞有选择性破坏作用，使其严重萎缩，从而减少INS的分泌，最终使小鼠血糖水平升高，引起2型糖尿病。在摄入黑豆皮可溶性膳食纤维后，糖尿病小鼠的胰岛面积和β细胞数增加，胰岛和β细胞有一定程度修复。

综上所述，黑豆皮可溶性膳食纤维具有较好的缓解糖尿病小鼠体质量，血糖、INS水平和抗炎因子的浓度，修复受损伤的胰岛组织的功能。本实验为黑豆皮可溶性膳食纤维产品的开发利用提供了理论依据。