线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂对冠心病大鼠血脂代谢和血管内皮损伤的影响及相关机制研究

谢玉霞，姜海兵，杨洁，刘文宁，梁铖，张静

冠心病属于缺血性心脏病，是指冠状动脉粥样硬化致使管腔狭窄或闭塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病。有研究表明，年龄、吸烟、血压、血脂有关成分、代谢相关因子、炎性因子、基因多态性、心理因素等与冠心病发生密切相关，其中血脂异常是诱发冠心病的一个重要因素［1］。目前，临床针对冠心病除采用扩张血管药物对症治疗外，还需给予控制心率、血脂、血糖等病因治疗。据《全球疾病负担研究》报道，冠心病是全球人类死亡的首要原因［2］。近年临床研究表明，多数冠心病患者伴严重高血脂及血管内皮损伤，因此调节血脂、减轻血管内皮损伤至关重要［3-4］。线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂是一种可延缓冠心病病情发展的有效药物，其对心肌缺血及再灌注损伤具有有效的保护作用［5］。二氮嗪是一种典型的线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂，常用于冠心病的临床治疗［6-7］，但其对血脂和血管内皮损伤影响及作用机制的报道相对较少。本研究旨在探讨线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂对冠心病大鼠血脂代谢和血管内皮损伤的影响及机制，以为临床研究提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018年8月—2019年2月，选取6周龄健康清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，平均体质量（180±20）g，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SYXK（x-2019-00002）。50只大鼠均在新疆医科大学附属中医医院实验室适应性饲养5 d，室温20～23 ℃，人工光照，阴暗各12 h，自由饮食。

1.2 主要药物、仪器 二氮嗪（上海博顿生物化工有限公司生产）、垂体后叶素（安徽宏业药业有限公司生产）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、血管内皮生长因子（VEGF）、β-actin抗体、山羊抗鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司生产）；HITACH17080全自动生化分析仪（上海曼普生物科技有限公司生产）。

1.3 实验方法 将50只6周龄大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。除对照组外，其他组大鼠均喂养高脂饲料（包含胆固醇1.0%，蛋黄粉5.0%，猪油10.0%，胆酸钠0.5%，基础饲料83.5%）6周，而后腹腔注射垂体后叶素6 U/kg，1次/d，持续3 d，进行造模。造模结束后，低、中、高剂量组大鼠分别按照二氮嗪3、5、7 mg/kg进行灌胃治疗，1次/d，而对照组、模型组大鼠给予相同体积0.9%氯化钠溶液，1次/d；5组大鼠均连续给药14 d。

1.4 标本采集 治疗后处死所有大鼠并采集其颈总动脉标本，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蜡包埋标本后连续切片，按照以下步骤进行HE染色：将石蜡切片置入烘箱（温度60 ℃）烤1～2 h→石蜡切片常规予以二甲苯，乙醇溶液脱蜡至水→苏木精染10 min→流水冲洗，去余色→0.7%盐酸乙醇分化数秒钟→流水冲洗，切片变蓝约15 min→95%乙醇溶液冲洗30 s→酒精性伊红染30 s→Ⅰ 95%乙醇溶液冲洗30 s→Ⅱ 95%乙醇溶液冲洗30 s→Ⅰ 100%乙醇溶液冲洗30 s→Ⅱ100%乙醇溶液冲洗30 s→石碳酸二甲苯冲洗30 s→Ⅰ二甲苯浸泡30 s→Ⅱ二甲苯浸泡30 s→中性树胶封固，最后置于光镜下观察。

1.5 观察指标

1.5.1 血脂指标 分别于治疗前后采集五组大鼠眼角静脉丛血2 ml，室温静置4 h，3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清液，利用全自动生化分析仪检测血脂指标，包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.5.2 羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性 治疗后摘除五组大鼠眼球并取血5 ml 3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清液800 μl，而后依次加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）100 μl、反应缓冲液（包括0.2 mol/L KCl、0.16 mol/L K2HPO4、4 mmol/L EDTA和10 mmol/L 二硫苏糖醇）100 μl，反应总体积为1 ml，先进行37 ℃预温浴20 min，而后采用紫外分光光度法检测OD340值，OD340值越高提示HMG-CoA还原酶活性越弱，反之活性越强。

1.5.3 颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量 治疗后在无菌条件下取五组大鼠颈动脉组织，加入裂解液和蛋白酶抑制剂后于4 ℃匀浆后继续裂解30 min，12 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），提取总蛋白；BCA蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜，用5%的脱脂牛奶对聚偏二氟乙烯（PVDF）凝胶电泳膜封闭2 h，而后以稀释后的β-actin、FGF-2及VEGF一抗于4 ℃孵育过夜，洗膜后室温孵育二抗1.5 h，洗膜后将PVDF膜浸入发光液，曝光并拍照，采用Western blotting法进行检测，并使用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组大鼠治疗前血脂指标比较 治疗前五组大鼠TC、TG、LDL-C水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗前五组大鼠HDL-C水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗前模型组及低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 五组大鼠治疗前血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

表1 五组大鼠治疗前血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of blood lipid parameters in the five groups before treatment

注：TC=总胆固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇；与对照组比较，aP＜0.05

组别 只数 TC TG LDL-C HDL-C对照组 10 1.34±1.13 0.61±1.10 0.19±0.91 0.55±1.21模型组 10 2.10±1.19a0.84±1.18a0.59±1.16a0.60±0.97低剂量组 10 1.98±1.24a0.83±1.11a0.60±0.92a0.58±1.16中剂量组 10 2.08±0.88a0.79±1.13a0.61±0.94a0.49±1.15高剂量组 10 2.00±0.97a0.81±1.09a0.57±1.18a0.62±0.99 F值 75.113 31.040 62.453 1.772 P值 0.001 0.018 0.001 0.211

2.2 五组大鼠治疗后血脂指标比较 治疗后五组大鼠TC、TG、LDL-C水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后五组大鼠HDL-C水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后模型组及低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平高于对照组，低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平低于模型组，中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平低于低剂量组，高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平低于中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 五组大鼠治疗后眼球血OD340值比较 治疗后五组大鼠眼球血OD340值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后模型组大鼠OD340值低于对照组，中、高剂量组大鼠OD340值高于对照组，低、中、高剂量组大鼠OD340值高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.4 五组大鼠治疗后颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量比较 治疗后五组大鼠颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后模型组及低、中剂量组大鼠颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量高于对照组，低、中、高剂量组大鼠颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4、图1）。

表2 五组大鼠治疗后血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

表2 五组大鼠治疗后血脂指标比较（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups after treatment

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

组别 只数 TC TG LDL-C HDL-C对照组 10 1.41±1.08 0.70±1.13 0.17±1.01 0.54±2.18模型组 10 4.50±2.11a 3.93±1.16a 2.68±0.93a0.58±1.81低剂量组 10 3.60±0.81ab 2.98±0.63ab 1.56±1.07ab0.56±1.69中剂量组 10 2.50±1.12abc2.01±1.15abc0.89±1.10abc0.47±1.72高剂量组 10 1.90±1.04abcd1.46±0.81abcd0.46±1.08abcd0.63±2.08 F值 20.190 71.353 375.844 2.390 P值 0.034 0.011 0.001 0.120

表3 五组大鼠治疗后眼球血OD340值比较（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

表3 五组大鼠治疗后眼球血OD340值比较（±s，mmol/L）Table 3 Comparison of eyeball blood OD340 in the five groups after treatment

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 只数 O D 340值对照组 1 0 0.4 5±4.3 2模型组 1 0 0.2 4±3.6 7 a低剂量组 1 0 0.4 2±4.1 1 b中剂量组 1 0 0.6 3±4.8 7 ab高剂量组 1 0 0.7 0±3.9 8 ab F值 2 9.0 2 6 P值 0.0 1 1

表4 五组大鼠治疗后颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量比较（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

表4 五组大鼠治疗后颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF相对表达量比较（± s，%）Table 4 Comparison of relative expression quantity of FGF-2 and VEGF of carotid vascular endothelial cells in the five groups after treatment

注：FGF-2=成纤维细胞生长因子2，VEGF=血管内皮生长因子；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 只数 FGF-2 VEGF对照组 10 20.63±2.12 24.57±1.13模型组 10 106.95±3.23a 100.66±2.97a低剂量组 10 68.80±2.76ab 74.93±1.68ab中剂量组 10 56.77±2.97ab 63.74±1.03ab高剂量组 10 25.56±2.46b 30.65±2.37b F值 570.478 1103.593 P值 0.024 0.011

3 讨论

图1 五组大鼠Western blotting检测结果Figure 1 Western blotting detection results in the five groups

冠心病是指冠状动脉粥样硬化导致管腔狭窄或闭塞，进而出现心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病。研究表明，血脂异常是诱发心血管事件的危险因素，血脂指标长期升高会破坏动脉完整性，导致血管破损，若血小板及血脂长期聚集于破损处或发生钙化，则会导致动脉管腔狭窄甚至闭塞，进而导致心脏病发生［8-9］。二氮嗪是一种线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂，现已广泛用于冠心病的治疗，但其对血脂和血管内皮损伤影响的相关报道相对较少［10］。本研究通过构建冠心病大鼠模型，探究线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂对冠心病大鼠血脂代谢及血管内皮损伤的影响及机制。

高胆固醇血症、高甘油三酯血症与冠心病存在一定关联［11］。高甘油三酯血症是冠心病的独立危险因素，LDL-C、TG、TC水平异常升高可诱发心血管斑块形成，长期积累加之肢体活动等可进一步导致斑块破裂，继而发生严重的心血管事件［12］。HMG-CoA还原酶是人体生物合成血脂过程中的限速酶，可催化底物HMG-CoA生成甲羟戊酸，是体内合成胆固醇的限速步骤，因此HMG-CoA还原酶活性与血脂水平密切相关，也是调节血脂药物的重要作用靶点［13-14］。本研究结果显示，治疗前模型组和低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平高于对照组，提示冠心病大鼠造模成功。治疗后模型组与低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平均高于对照组，低、中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型组，中、高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于低剂量组，高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C水平均低于中剂量组，但五组大鼠HDL-C水平间无差异，可见二氮嗪可明显降低冠心病大鼠LDL-C、TG、TC水平，但不明显改变HDL-C水平。另外，治疗后模型组大鼠OD340值低于对照组，中、高剂量组大鼠OD340值高于对照组，低、中、高剂量组大鼠OD340值高于模型组，表明该药物可通过抑制HMGCoA还原酶活性达到降血脂的作用。

在血管形成过程中，有诸多血管生长因子如FGF-2、VEGF参与调节。FGF-2可刺激蛋白酶原活化因子与内皮细胞分泌蛋白酶，导致血管基底膜降解，使细胞侵入周围基质，从而形成新的、具有空腔的血管。VEGF能够特异性促进血管内皮细胞分裂及增殖，促进血管生成，增强血管通透性，使血管内成分渗漏，但FGF-2、VEGF过表达可导致血管内皮破损［15-16］。本研究结果显示，治疗后低、中、高剂量组大鼠FGF-2、VEGF相对表达量低于模型组，表明二氮嗪能够明显降低冠心病大鼠FGF-2和VEGF表达量，提示可通过下调FGF-2和VEGF表达量达到减轻血管内皮损伤的目的。

综上所述，线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂可通过抑制HMG-CoA还原酶活性而改善冠心病大鼠血脂代谢，并可通过下调颈动脉血管内皮细胞FGF-2及VEGF的表达量而减轻血管内皮损伤，但本研究并未对FGF-2及VEGF相关信号通路中其他蛋白的表达进行研究，因此线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂对冠心病大鼠的血脂及血管保护作用具体机制还需进一步探讨。

作者贡献：谢玉霞、姜海兵、杨洁进行文章的构思与设计；谢玉霞、杨洁、刘文宁、梁铖进行研究的实施与可行性分析；谢玉霞、梁铖、张静进行数据收集、整理、分析；杨洁、刘文宁、张静进行结果分析与解释；谢玉霞撰写论文，进行论文的修订；谢玉霞、姜海兵负责文章的质量控制及审校；姜海兵对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。