油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）T-DNA插入突变体表型特征分析

史志丹，宋培玲，郝丽芬，皇甫海燕，燕孟娇，杨永青，吴 晶，赵丽丽，李子钦

（1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010070；2.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

油菜黑胫病是一种重要的真菌病害[1]，寄主范围广泛，能侵染多科植物，但主要侵染十字花科植物[2-3]。油菜黑胫病菌可以通过感染的油菜茎秆在季节与季节、作物与作物之间传播，油菜的子叶、真叶、茎秆、根以及荚果等都有可能被黑胫病原菌侵染，造成幼苗或成株死亡并导致菜籽产量和品质降低[4-6]。致病菌为强侵染型（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型（Leptosphaeria biglobosa）的复合种，强侵染型黑胫病菌（L. maculans）在培养基上的生长速度较慢，形成白色平坦菌落，分生孢子器相对较少，释放黄色至深棕色的色素。弱侵染型（L. biglobosa）黑胫病菌在培养基上的生长速度较快，菌落规则，分生孢子器相对较多，但主要集中在菌落中央，菌丝的气生部分会形成黄色或褐色的液体小滴[7-8]。因此，不同的菌株在菌株致病性强弱、菌落生长速度、分生孢子器产生的数量、色素物质的形成和积累上都有差异。目前，在我国尚未发现L. maculans，但L. biglobosa 作为油菜的一种病害已经在我国普遍发生，并对长江流域的油菜产区造成了一定的经济损失，而对油菜黑胫病的防治工作刚刚起步[9-10]。因此，揭示黑胫病菌与油菜互作过程对于研究黑胫病的致病机理具有重要意义。笔者对黑胫病菌（L.biglobosa）T-DNA 插入突变体的主要表型进行了鉴定，旨在为后续黑胫病菌与油菜互作机制的研究提供材料基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试油菜品种为甘蓝型油菜青杂5 号。原始菌株黑胫病菌株（L. biglobosa）nm-1 由内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所分离保存并经分子生物学鉴定为L. biglobosa。供试菌株是本课题组利用农杆菌介导的遗传转化法获得的GFP 标记的黑胫病菌突变体。

1.2 主要试剂和培养基

主要试剂溴甲酚绿（Bromocresol green）、刚果红（Congo red）、 羧甲基纤维素（Craboxy methyl cellulose）、果胶（Pectin from apple）、可溶性淀粉、脱脂奶粉均购自Biotopped 公司。培养基为PDA 培养基，查比克培养基。

1.3 方法

1.3.1 突变体生长速度测定及菌落形态观察 接种突变体于PDA 平板上，25 ℃恒温培养7～12 d，于12 d观察记录菌落形态，并用十字交叉法测量菌落直径，设3 次重复，野生型黑胫病菌株nm-1 为对照。

1.3.2 突变体产孢量测定 接种突变体于PDA 平板上，25 ℃恒温培养14 d。在平板上添加3 mL 无菌水，静置10 min 后，用载玻片轻轻刮平板表面，用双层无菌纱布过滤获得孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计数孢子量[11]，设3 次重复，野生型黑胫病菌株nm-1 为对照。

1.3.3 突变体致病力测定 在供试油菜子叶期采用穿刺法接种，在伤口处接种10 μL 分生孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为1×106个/mL。20 ℃黑暗条件下套袋保湿48 h，在16 h 光照/8 h 黑暗条件下培养8 d后，以野生型黑胫病菌株nm-1 为对照，参考李欣洲[12]的油菜黑胫病病情分级标准来统计油菜发病情况。

1.3.4 生长速度、产孢量、病情指数间的相关性 利用软件SPSS 24.0 对突变体的生长速度、产孢量、病情指数进行相关性分析。

1.3.5 突变体胞外酶检测 将待测突变体接种于以下不同培养基平板上，25 ℃恒温培养12 d。以野生型黑胫病菌株nm-1 为对照，通过比较菌落外围透明圈的大小和有无，来检测不同菌株间胞外酶分泌的差异，具体方法如下：（1）将待测菌株接种于含有1%脱脂奶粉的查比克培养基上，观察不同菌株蛋白酶分泌的差异。（2）将待测菌株接种于含有0.1%可溶性淀粉的查比克培养基上，用1∶100 的I2/KI（0.08 mol/L I23.2 mol/L KI）染色10 min，依次用75%的乙醇洗脱2 次，无菌水洗脱2 次，观察不同菌株淀粉酶分泌的差异。（3）将待测菌株接种于含有1%果胶的查比克培养基上，用0.005%的溴甲酚绿染色后，观察不同菌株果胶酶分泌的差异。（4）将待测菌株接种于含有1%纤维素的查比克培养基上，用20 mL（0.1%）的刚果红溶液染色20 min，依次用无菌水洗脱两次，用20 mL NaC（l1 mol/L）脱色两次，每次20 min。观察不同菌株纤维素酶分泌的差异。

2 结果与分析

2.1 突变体菌落形态观察

前期试验通过农杆菌介导的遗传转化获得121 个突变体，对突变体的菌落形态进行观察，发现大多数突变体菌落形态与野生型黑胫病菌株nm-1相近，只有6 个突变体与野生型黑胫病菌株nm-1菌落形态差异较为明显。菌落形态如图1 所示，有3 个突变体T21、T29、T30 与野生型黑胫病菌株nm-1菌落形态有明显差异，其中突变体T21 和T30 菌落边缘呈现不规则形态，而突变体T29 在PDA 平板上培养12 d 后，菌落未在培养基上生长。与野生型黑胫病菌株nm-1 相比，突变体T34 菌丝生长状态和孢子分布相近，突变体T1、T12、T21、T29、T30、T35的菌丝生长状态和孢子分布具有明显差异。突变体T1、T34、T35 产孢量与野生型黑胫病菌株nm-1 相近，突变体T12、T21、T30 产孢量比野生型黑胫病菌株nm-1 明显减少，而突变体T29 未产孢。突变体在培养过程中均有色素产生，且色素颜色与野生型黑胫病菌株nm-1 相近，但突变体T12 色素颜色偏红褐色与野生型黑胫病菌株nm-1 明显不同。

2.2 突变体菌株生长速度

突变体菌落生长速度测定结果如图2a 所示。各突变体的生长速度与野生型黑胫病菌株nm-1 相比均有所下降。下降幅度最大的是突变体T32，其菌落直径为6.67 cm，与野生型黑胫病菌株nm-1（8.07 cm）相比其菌落直径下降了18.3%。其次菌落直径下降较多的是突变体T8、T10、T17、T30，其菌落直径分别为7.19、6.89、7.14、7.01 cm，与野生型黑胫病菌株nm-1 的菌落直径相比分别下降了10.9%、14.6%、11.5%、13.1%。其余突变体菌株下降幅度较小，但仍与野生型黑胫病菌株nm-1 有显著差异（P<0.05），其中突变体T4、T34 的菌落直径均为7.83 cm，与野生型黑胫病菌株nm-1 的生长速度最接近。

2.3 突变体菌株产孢量测定

突变体的产孢量测定结果如图2b 所示。检测的26 个突变体中，96%的突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 相比产孢量显著下降。野生型黑胫病菌株nm-1 的产孢量为3.84×106个/mL，其中下降最明显的是突变体T9、T12、T14，产孢量分别为0.39×106、0.36×106、0.37×106个/mL，与野生型黑胫病菌株nm-1相比分别下降了89.8%、90%、90.3%。突变体T31和T34 产孢量分别为3.27×106、3.11×106个/mL，与野生型黑胫病菌株nm-1 最为接近，且差异不显著（P>0.05），只有突变体T13 产孢量显著高于nm-1，为8.9×106个/mL，与野生型黑胫病菌株nm-1 相比提高了56.8%。

2.4 突变体菌株致病性测定

突变体致病性测定结果如图2c 所示。检测的26 个突变体中，53%的突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 相比致病力无显著差异（P>0.05），其中突变体T3、T12、T34、T36 与野生型黑胫病菌株nm-1病情指数最接近。7 个突变体（T17、T21、T27、T28、T30、T31、T32）病情指数与野生型黑胫病菌株nm-1相比显著上升，其病情指数分别为83.33、80.00、70.00、87.50、83.06、67.50、83.05，与野生型黑胫病菌株nm-1相比分别提高87.2%、79.7%、53.8%、96.6%、86.6%、48.4%、86.6%。突变体T2、T16、T18 的病情指数有所上升，其病情指数与野生型黑胫病菌株nm-1 相比分别提高23.0%、16.1%、24.5%。突变体T11 的病情指数与野生型黑胫病菌株nm-1 相比显著降低，其病情指数为29.54，与野生型黑胫病菌株nm-1 相比降低33.60%。

2.5 突变体菌株生长速度、产孢量、病情指数间的相关性

对所测突变体和野生型菌株的生长速度、产孢量、病情指数之间的相关性进行分析发现，生长速度与病情指数之间存在显著负相关，生长速度与产孢量、产孢量与病情指数之间不存在显著相关性（表1）。

2.6 突变体菌株胞外酶测定

表1 菌株生长速度、产孢量、病情指数之间的相关性

突变体菌株胞外酶分泌测定结果如图3 所示。突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 在添加脱脂奶粉和可溶性淀粉的查比克培养基上均能产生透明圈（图3a、图3b），所测菌株在添加脱脂奶粉的查比克培养基上均未产生分生孢子，在添加可溶性淀粉的查比克培养基上菌丝生长稀疏且均未产生分生孢子，表明突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 都具有蛋白酶和淀粉酶分泌的能力，外源基因的插入对突变体蛋白酶和淀粉酶的合成与分泌无影响。突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 在添加果胶和纤维素的查比克培养基上均未产生透明圈（图3c、图3d），所测菌株在添加果胶的查比克培养基上菌丝正常生长但未产生分生孢子，在添加纤维素的查比克培养基上菌落生长异常，菌丝稀疏并且不产生分生孢子，表明突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 均无分泌果胶酶和纤维素酶的能力。含果胶的查比克培养基虽然适宜菌丝体生长，但不利于产孢。

3 讨论与结论

通过农杆菌介导真菌的遗传转化，不能确定T-DNA 外源基因插入的位置，也不能确定插入基因的稳定性[13]，T-DNA 的插入位点不同可能对病原菌的一些性状产生影响，有些可能与病原菌的生长和致病性相关。因此，需要从已获得的黑胫病菌突变体中筛选出遗传稳定且生物学性状和致病性都没有发生显著变化的突变体菌株侵染油菜。对突变体的菌落形态进行观察，发现多数突变体的菌落形态与野生型黑胫病菌株nm-1 相近，只有个别突变体在色素颜色和菌落生长状态方面有较大变异。突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 在菌落生长速度和产孢量方面相比，多数突变体的生长速度和产孢量都显著下降。盖晓彤[14]在玉米茎腐病和稻腐病的研究中表明，禾谷镰孢菌野生型菌株的产孢量均高于其相应突变体，而轮枝镰孢菌野生型菌株的产孢量低于其突变体。说明对不同病原菌的突变体在产孢量方面表现不同。突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 相比，突变体的致病性并没有因产孢量的下降而减弱，而多数突变体产孢量低于野生型黑胫病菌株nm-1，但多数突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 的致病力没有显著差异，甚至致病性更强一些，只有1 株致病力是减弱的，表明黑胫病菌的致病性与产孢量无明显相关性。同时对突变体和野生型黑胫病菌株的生长速度、产孢量、病情指数进行相关性分析发现，产孢量与病情指数之间不存在显著相关性，但生长速度与病情指数之间显著负相关。而王晓楠[15]在研究棉花黄萎病时其突变体产微菌核能力降低，致病力也显著下降，说明棉花黄萎病菌的致病力与微菌核的产生可能存在一定程度正相关性。但周芳芳等[16]在对棉花黄萎病菌突变体产孢量、生长速度、粗毒素、致病性之间相关性研究中发现四者之间不存在明显的相关性，表明不同病原菌的突变体在致病性与表型没有相关性。胞外酶在营养吸收、自我保护和入侵植物细胞等方面都有重要作用。长期以来，关于真菌胞外酶研究最多的是果胶酶和纤维素酶，除此之外，在病原菌侵染植物过程中产生的蛋白酶有助于病原菌穿过植物细胞壁，降解植物的相关防御蛋白[17]。本研究中获得的突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 在含脱脂奶粉和可溶性淀粉的培养基上均可以正常生长并产生透明圈，说明突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 一样，可以分泌蛋白酶和淀粉酶。突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 在含果胶和纤维素的培养基上不产生透明圈且不能正常生长，说明突变体与野生型黑胫病菌株nm-1 一样，不能分泌果胶酶和纤维素酶。外源基因的插入不影响黑胫病菌突变体胞外酶的分泌，也没有产生营养缺陷型突变体。而徐荣旗[18]在研究棉花黄萎病时发现，T-DNA 插入突变造成了约3%的营养缺陷型，说明T-DNA 的插入可能会导致某个合成或分解代谢基因功能的丧失，影响病原菌对某种营养物质的分解利用及其生长，继而可能影响其致病性。除添加纤维素的培养基外，突变体和野生型黑胫病菌株nm-1 在PDA 培养基上均可正常产孢，但在查比克培养基上均未产孢，这与郝丽芬[19]在研究不同碳源对黑胫病病原菌生长影响的结果相同。本研究最终获得了与野生型黑胫病菌株表型相近的突变体，携带GFP 基因的突变体T34 可以作为野生型黑胫病菌株的替代菌株，示踪菌株的侵染过程而进一步研究植物与病原菌的互作机制。