固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测环境水体中18种农药残留

杨 松, 邹 楠, 高 云, 许乐园, 张文文, 潘灿平, 慕 卫,*

(1. 山东农业大学植物保护学院农药毒理与应用技术省级重点实验室, 山东 泰安 271018; 2. 山东农业大学农药环境毒理研究中心, 山东 泰安 271018; 3. 中国农业大学理学院应用化学系, 北京 100193)

农药是一类特殊的化学品,使用农药是我国病虫害防治的主要手段,对防控农作物病虫害、保障农业生产安全和国家粮食安全发挥了重要作用[1]。农药具有生物累积性、环境难降解性以及对人体的“三致效应”(致癌、致畸、致突变)等[2],因此不合理的使用会对人体和环境造成极大危害。长期以来,由于农药的不当管理及使用,多种环境介质中均有农药被检出,其中水环境的农药污染尤为严重。水环境是与人类接触密切的环境介质,具有较强的污染物迁移能力[3],农药可以通过污水排放、农业灌溉径流、干湿沉降、大气/水交换等方式最终富集进入水环境[4]。水体环境中的农药污染问题是近几年研究的热点,目前已有文献[5]报道发现不同地域的各类环境水体中有不同类型的农药被检出。因此,在分析各类环境水体中不同类型农药残留时,不仅要求分析方法具有较高的灵敏度,还要求前处理方法有良好的富集、净化和通用性。

目前,已有较多研究报道了水体中农药多残留分析方法,例如王为中等[6]报道了磁固相萃取与高效液相色谱法联用测定水体中防治白蚁的农药残留,杨梅[7]报道了液液萃取-气相色谱法测定水体中45种有机氯和菊酯类农药残留。综合来看,较常用的分析方法主要有气相色谱法[8,9]、液相色谱法[10,11]、气相色谱-串联质谱法[12-14]和液相色谱-串联质谱法[15-17]等。在进行水体中农药残留检测时固相萃取(SPE)相比于液液萃取具有高效、简便、快速、安全、重复性好、可进行富集浓缩和便于前处理自动化等优点,被广泛应用于水体中农药残留检测,是水体中农药多残留检测最重要的前处理方法之一[18,19]。当前,Cleanrt®-S C18、Cleanrt®-Silica和Cleanrt®-PEP 3种不同填料类型的固相萃取柱广泛应用于水体中农药残留分析的前处理[20]。水样通过自动大体积浓缩(AUTO Prep)前处理技术来实现超大体积进样,能满足ng/L级样品的定量检测,这极大地提高了分析方法的灵敏度[21]。采用大体积萃取装置与固相萃取柱串联,可极大提高环境水体的富集倍数,降低定量限。目前,不同极性农药的同时检测已出现提取效率不一致、回收率不稳定的现象,如能建立一种通用性强,能同时对不同极性范围农药进行前处理的方法,可极大地提高分析效率和节约成本。例如,张凌怡等[22]报道了C18修饰的磁性纳米材料用于不同性质农药的固相萃取理论研究。该方法具有通用性强、灵敏度高、稳定性好和简便省时的优点。

化工园区中所包含的企业有染料行业、医药行业、农药行业等多个化工类相关行业,涉及的废水具有高酸性、颜色浓、氨氮含量高和含盐量高等特点[23],在进行农药多残留检测时难度较大。

本文选取了低、中和高不同极性范围的18种农药作为研究对象,采用大体积固相萃取装置进行样品净化和富集浓缩,考察了Cleanrt®-PEP、Cleanrt®-S C18和Cleanrt®-Silica 3种不同吸附填料固相萃取柱对地表水体(河流和水库)以及化工污水净化和富集浓缩的效果，绘制了18种农药在3种不同吸附类型固相萃取柱上的吸附洗脱曲线,明确了不同极性范围目标化合物在固相萃取柱上的吸附和洗脱特性。基于大体积固相萃取仪，研究并建立了同时检测环境水体中不同极性18种农药残留的分析方法,并将方法应用于泰安市周边地区河流和水库以及化工厂区污水农药残留检测。该方法具有灵敏度高、重复性好、操作简单和通用性强等优点,适用于水体中农药残留检测,可为环境水体中痕量农药残留检测提供有力的技术支持,对水环境保护意义重大。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

ACQUITY UPLC-H-Class Xevo-TQSMicor超高效液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾电离(ESI)源)、ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)(美国Waters公司);固相萃取仪(YGC-8,郑州宝晶电子科技有限公司); Cleanrt®-PEP固相萃取柱(500 mg/6 mL,天津博纳艾杰尔科技公司);万分之一天平(北京赛多利亚科学仪器有限公司);瓶口分液器(德国Dispensette公司);移液器(德国Eppendorf公司);漩涡振荡器(德国Irmsci公司)。

噻虫嗪、吡虫啉、噻虫胺、啶虫脒、乐果、甲霜灵、嘧霉胺、噻呋酰胺、丙环唑、吡唑醚菌酯、吡丙醚、毒死蜱、乙螨唑、丁醚脲、螺螨酯、丁硫克百威、醚菊酯和联苯菊酯标准品(含量均在98%以上)购自中国标准物质中心;甲醇和乙腈(色谱纯,德国Merck公司);乙酸胺和甲酸(分析纯,上海阿拉丁试剂有限公司);高温蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.2 标准溶液配制

准确称取一定量18种农药标准品,用乙腈溶解,配制成500 mg/L 的混合标准溶液,再依次用乙腈和空白基质乙腈洗脱液稀释成0.5、1.0、2.5、5.0、25和50 μg/L 的系列混合标准溶液,所有标准溶液于-18 ℃下保存,备用。

1.3 样品采集

在泰安南部高新工业园区及周边河流和水库设置12个水样采集点,HWHG-01、HWHG-02、MN-01和MN-02为化工厂区排放污水,PH、WH、QLH、MTH、WH和SLH为泰安市周边河流,SLSK和HQSK为周边水库。在每个采集位点用棕色瓶采集水面下20 cm处2 L水样,迅速运回实验室,水样过0.45 μm滤膜,待前处理和检测。

1.4 样品前处理

先用4 mL正己烷淋洗Cleanrt®-PEP固相萃取柱,消除填料上的杂质。然后分别用6 mL甲醇和5 mL纯水活化。

采用大体积固相萃取装置将300 mL水样以2 mL/min 的速率通过Cleanrt®-PEP固相萃取柱,然后用4 mL纯水进行清洗,再用6 mL的乙腈进行洗脱,收集洗脱液,过0.22 μm有机滤膜,待检测。

1.5 分析条件

色谱柱:ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温:35 ℃;流速:0.30 mL/min;流动相:A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液(含2 mmol/L 乙酸铵), B为乙腈。梯度程序:0～3.5 min, 90%A～2%A; 3.5～5.0 min, 2%A; 5.0～5.1 min, 2%A～90%A; 5.1～6.5 min, 90%A。进样体积:2 μL。

离子源:ESI源,正离子模式;离子源温度:150 ℃;毛细管电压:3.0 kV;脱溶剂温度:550 ℃;脱溶剂气流速:1 000 L/h;锥孔反吹气流速:30 L/h;监测模式:多反应监测(MRM)模式。MRM模式下18种农药的质谱参数见表1。

表 1 MRM模式下18种农药的质谱参数Table 1 MS parameters of the 18 pesticides in MRM mode

* Quantitative ion pair.

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

甲酸和乙酸铵为ESI+模式下增强目标化合物[M+H]+和[M+NH4]+离子化程度的常用试剂,并且均能有效改善峰形,使峰形更加尖锐和对称[24]。联苯菊酯为[M+NH4]+离子化模式,其他为[M+H]+,为确保目标化合物均能获得最佳灵敏度,本研究比较了有机相为乙腈,水相为纯水、0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液(含2 mmol/L 乙酸铵)时目标化合物的响应强度(见图1)。结果表明,水相为纯水时目标化合物响应极低;0.1%的甲酸加2 mmol/L 乙酸铵水溶液与乙腈流动相体系时所有目标化合物响应强度略高于0.1%的甲酸水与乙腈流动相体系。因此选0.1%的甲酸水溶液(含2 mmol/L 乙酸铵)与乙腈作为流动相。通过不断优化梯度洗脱程序,最终在6.5 min内将18种杀虫剂有效分离(见图2)。与何欣等[25]报道的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时检测环境水样中24种农药残留比较,检测时间由24 min缩短至6.5 min,大幅度节省了检测时间,提高了工作效率。

图 1 采用不同流动相水相时18种农药的响应强度(n=3)Fig. 1 Response intensities of the 18 pesticides using different water phase of mobile phase (n=3)

图 2 MRM模式下18种农药(50 μg/L)的TIC色谱图Fig. 2 Total ion current chromatograms of the 18 pesticides (50 μg/L) in MRM mode

以18种农药混合标准溶液(0.5 mg/L)为调试液进行手动调谐,优化每种农药的母离子和子离子,获得最佳的锥孔电压和碰撞能,选取两组灵敏度最佳的离子对进行检测,一组用来定量,另一组辅助定性,并且采用分段式MRM模式进行检测。

2.2 固相萃取柱的选择

Cleanrt®-S C18固相萃取柱填料为C18烷基硅胶,对非极性和弱极性化合物具有很好的保留能力;Cleanrt®-Silica固相萃取柱的填料是未键合的硅胶,对中等性化合物有较好的保留效果;Cleanrt®-PEP固相萃取柱的填料为官能化聚丙乙烯/二乙烯本,表面同时具有亲水性和憎水性集团,对各类极性和非极性化合物具有较均衡的萃取效果[20]。以乙腈为洗脱溶液,考察了添加水平为1 μg/L 时上述3种不同吸附类型的固相萃取柱对18种不同极性范围农药的萃取和浓缩效果。结果表明,Cleanrt®-PEP固相萃取柱对水体中18种不同极性范围的农药有较均衡的吸附与保留效果,18种农药的回收率均在81.1% ～101.2%之间;Cleanrt®-S C18处理组18种农药的回收率为42.0% ～102.1% ,对弱极性农药有较高的回收率,其中乐果、噻虫胺、噻虫嗪、丁硫克百威和噻呋酰胺等高极性农药的回收率偏低,在59.0%以下;Cleanrt®-Silica固相萃取柱对嘧霉胺、啶虫脒、乐果、噻虫胺、吡虫啉、甲霜灵和噻虫嗪等高极性农药有较好的吸附保留效果,回收率在75.1% ～97.3%之间,弱极性农药的回收率低于30%(见图3)。综上,本研究选用Cleanrt®-PEP固相萃取柱进行前处理。

图 3 不同固相萃取柱对18种农药回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effects of different solid-phase extraction columns on the recoveries of the 18 pesticides (n=3)

2.3 洗脱体积的优化

本着目标化合物能被完全洗脱,并获得高回收率,且节约溶剂的原则,实验对洗脱溶液用量进行了优化。采用10 mL乙腈进行洗脱,每1 mL收集1次,进行检测,重复处理3次。以洗脱液体积为横坐标,对应目标化合物峰面积为纵坐标绘制洗脱曲线(见图4)。结果表明,除噻呋酰胺外,其余17种农药的洗脱曲线类型相似,在洗脱液体积为6 mL时目标化合能完全物洗脱,为保证目标化合物均能完全洗脱,最终确定洗脱体积为6 mL。

图 4 采用乙腈洗脱时18种农药的洗脱曲线(n=3)Fig. 4 Elution curves of the 18 pesticides when eluting with acetonitrile (n=3)

2.4 基质效应、标准曲线和定量限

基质效应(ME)是影响定量准确度的关键因素之一,会对目标化合物的准确定量造成较大影响,在建立分析方法之前须对待测物进行基质效应的评估,并采取有效措施进行消除或补偿,以提高分析方法的可靠性[26]。目前ME的评价方法常以基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率之比进行评估,当0.8≤ME≤1.2时为无明显基质效应,ME<0.8时为基质抑制效应,ME>1.2时为基质增强效应[27]。

分别以地表水体和化工厂区污水为空白基质进行浓缩富集,以其乙腈洗脱液为溶剂配制基质标准溶液,同时用乙腈配制溶剂标准溶液。以基质和溶剂标准溶液的质量浓度为横坐标(x, μg/L),其对应的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线(见附表1,详见http:/ /www.chrom-China.com)。结果表明,在0.5～50 μg/L 范围内18种农药在3种基质中的线性关系良好,相关系数(R2)≥0.995。地表水的ME值在0.88～1.16之间,呈现弱基质效应;化工污水中乐果、噻呋酰胺和乙螨唑的ME值分别是0.67、0.79和0.79,为基质抑制效应,联苯菊酯、吡虫啉和毒死蜱的ME值是1.58、1.29和1.27,为基质增强效应,为提高分析方法的可靠性,本文采用基质标准曲线进行定量分析。

参照《农药残留试验准则》[28]要求,以添加回收最低水平作为分析方法的LOQ,环境水体中18种农药的LOQ均为10 ng/L。

2.5 准确度和精密度

欧盟规定农药在水体中的MRL值为100 ng/L,以MRL值为添加回收中间水平,以LOQ作为添加回收最低水平,10倍MRL值作为添加回收最高水平,分别向2种环境水体进行3个添加水平的加标回收试验,每个水平重复5次,计算回收率和相对标准偏差。结果表明,18种农药在不同环境水体中的平均回收率均为71.3% ～105.9% , RSD为1.3% ～9.9%(见表2)。方法的回收率和精密度均符合水体中农药残留检测要求[29]。

表2 18种农药在地表水和化工污水中的加标回收率及相对标准偏差Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of the 18 pesticides in surface water and chemical sewage

2.6 实际样品的检测

将建立的SPE-UPLC-MS/MS分析方法用于泰安市南部高新工业园区及周边河流和水库10个采集位点水样检测。结果表明，所有采集位点检测结果均低于10 ng/L,均未检出18种农药残留。

3 结论

本研究建立了SPE-UPLC-MS/MS同时检测环境水体中18种农药残留的分析方法,并将方法应用于泰安市周围地区河流水、水库水和化工厂区排放污水3种环境水体中的农药残留检测。该方法具有操作简便、净化效果好、高回收率、通用性强和灵敏度高等优点,适用于河流、水库和化工厂区排放污水样品的检测,具有很强的实际应用价值,可为泰安地区水环境农药污染的监管监测提供理论依据和技术支撑。