小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体制备

许君，薛继初，姬凯，李小玲，徐朝

(河南农业大学生命科学院，河南 郑州 450002)

含α/β水解结构域(abhydrolase domain containing，ABHD)丝氨酸酶16A(abhydrolase domain containing 16A，ABHD16A)是含558个氨基酸残基、相对分子质量(Mr)为63 kD的膜蛋白，在多种哺乳动物细胞中表达，属于ABHD超家族成员之一。研究显示ABHD家族的蛋白显示出酯酶、蛋白酶、过氧化物酶、氧化物水解酶和脱卤酶等多种酶活性，与脂代谢、细胞信号转导及多种代谢障碍等有关[1-2]。ABHD16A基因编码的蛋白质又被称为人类白细胞抗原B相关转录物5(HLA-B associated transcript 5,BAT5)，因其与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和TNF-β、热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)等基因的位置靠近，都位于Ⅲ类主要组织相容性抗原复合体(major histocompatibility complex class Ⅲ,MHC class Ⅲ)区域内，推测ABHD16A可能也与机体免疫相关[3]。此后对ABHD16A功能方面的研究比较欠缺，直到近几年才开始有相关研究的报道。已有研究结果显示，ABHD16A可能与神经退行性疾病[4]、免疫调节[5]、川崎病与冠状动脉瘤[6]有关。为进一步研究ABHD16A的功能和潜在的免疫调节作用，针对目前商业化的ABHD16A抗体特异性差，灵敏度低等现状，本研究拟通过原核表达得到人ABHD16A(human ABHD16A,hABHD16A)蛋白，通过免疫小鼠获得ABHD16A的多克隆抗血清，为后续的功能研究及分子机制探索提供可用的抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c小鼠购于河南省实验动物中心，HepG2人肝癌细胞、含有猪ABHD16A的表达质粒pCDNA3.1-sABHD16A和E.coliDH5α及E.coliBL21(DE3)感受态细胞为河南农业大学生命科学院实验室保存。pET28a(+)、pMD19-T载体、TaqDNA聚合酶及限制性内切酶购于大连宝生物公司。反转录试剂盒、RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒及 DNA回收试剂盒等均购于TIANGEN公司。卡那霉素、氨苄青霉素等购于鼎国生物工程公司。TurboFect转染试剂购自Thermo公司。二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司。HPR染色试剂盒，异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，Triton X-100以及乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)购自北京索莱宝科技有限公司。Tris-HCl购于Biosharp公司。胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司。DMEM购自美国HyClone公司。其余一般试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌HepG2细胞的培养 按常规方法复苏HepG2细胞，培养在含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃、95%相对饱和湿度、pH 7.4、50 mL·L-1CO2条件下培养至对数生长期，将贴壁生长的细胞用500 μL的2.5 g·L-1胰蛋白酶完全消化后，加入1 mL完全培养基终止反应。细胞悬液收集于1.5 mL 离心管中，室温900 r·min-1离心5 min，弃去培养基，再用1 mL PBS相同条件下冲洗1次，弃上清液，留细胞备用。

1.2.2 hABHD16A CDS区基因克隆 按照TRIzol试剂盒的操作说明提取细胞总RNA，采用琼脂糖电泳和核酸浓度仪检测RNA质量和浓度。按照反转录试剂盒的操作说明去除基因组DNA和反转录合成的cDNA第一链。据GenBank报道的hABHD16A基因(NM_001177515.1)为参照序列，设计引物，正向引物为5′-TCATGGCGAAGCTGCTGAG-3′，反向引物为5′-CGGGATCCTAGAGGTGCCAGGGCATC-3′。反应条件为：95 ℃预变性2 min，(95 ℃，20 s； 60 ℃，20 s；72 ℃，90 s)，共35个循环，72 ℃总延伸10 min。10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并回收目的DNA条带。回收的样品与 pMD19-T 载体于 4 ℃过夜连接，将连接产物转化至DH5α感受态，对重组质粒进行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切验证，将验证为阳性的克隆进行测序，测序结果提交NCBI进行BLAST序列比对，序列正确的阳性质粒命名为pMD19-T-hABHD16A。

1.2.3 重组hABHD16A的原核表达 将pMD19-T-hABHD16A质粒与pET-28a(+)分别通过BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ双酶切，回收hABHD16A片段和线性化pET-28a(+)载体，经T4 DNA连接酶过夜连接后，转化至感受态细胞，将PCR验证正确的pET28a-hABHD16A导入E.coliBL21(DE3)感受态，PCR验证阳性克隆。挑取阳性克隆子单菌落于LB液体培养基，37 ℃，220 r·min-1振荡至A600=0.6，加入IPTG (终浓度1 mmol·L-1)诱导6 h，离心收集菌体后超声波破碎，收集破碎后的上清液和沉淀，SDS-PAGE检测原核诱导表达情况。

1.2.4 重组hABHD16A包涵体的纯化 将破碎后的沉淀用预冷的缓冲液B(50 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1EDTA、Triton X-100，pH 7.9)洗涤4次，再用预冷的缓冲液C(50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1DDT、pH 7.9)洗沉淀2次，取0.1 mg纯化的包涵体蛋白，用SDS-PAGE检测纯度和测定蛋白浓度，换算成包涵体蛋白实际含量后，依照本研究中的小鼠免疫程序，分装包涵体蛋白，于-80 ℃保存备用。

1.2.5 免疫原制备与动物免疫 分别采用包涵体和切割SDS-PAGE目的蛋白条带的方式制备两类免疫原。依照小鼠免疫程序计算包涵体蛋白用量，依量减半加入Freund完全佐剂或者Freund不完全佐剂，混匀，转移至无菌离心管内，至-80 ℃储存备用。依照本研究中的小鼠免疫程序计算包涵体蛋白量并进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝G250染色并脱色后，用无菌生理盐水漂洗 SDS-PAGE 胶片数次，将目的条带完整切割分离，逐个依量减半加入Freund完全佐剂或者Freund不完全佐剂，在洁净无菌的研钵内充分研磨混匀，再转移至无菌离心管内，至-80 ℃储存备用。

将6只体重和年龄相当的小鼠分为A、B 2组，每组各3只小鼠， 每组均设对照，A1、A2、B1、B2为试验组，采用皮下多点和腹部注射相结合的方式进行免疫，A组采用包涵体制备的免疫原，首次免疫时对照组注射200 μL Freund不完全佐剂，A1+、A2+分别注射200 μL免疫原(包涵体蛋白量约为25 μg)，一免之后每隔7 d进行一次免疫，连续3次，每次免疫时A-注射300 μL Freund完全佐剂，A1+、A2+分别注射300 μL免疫原(即每只小鼠注射的包涵体蛋白量约为50 μg)。 B组采用切割SDS-PAGE目的条带制备的免疫原，首次免疫时B对照组注射100 μL 含30%Freund不完全佐剂的空白蛋白胶研磨物，B1+、B2+分别注射100 μL免疫原(蛋白量约为25 μg)，一免之后每隔7 d进行一次免疫，连续3次，每次免疫时B对照组注射300 μL含30%Freund完全佐剂的空白蛋白胶研磨物，B1+、B2+分别注射300 μL免疫原(每只小鼠注射的蛋白量约为50 μg)。

1.2.6 hABHD16A多克隆抗血清的制备、效价测定 将试验小鼠麻醉后摘眼球采血，血样3 000 r·min-1离心5 min，取上层血清，加入NaN3溶液(终浓度为0.2 mmol·L-1)和甘油(终浓度为50%)，分装并储存于-80 ℃。采用斑点杂交(Dot-Blot)技术，将不含溴酚蓝SDS-PAGE Loading Buffer溶解变性的hABHD16A包涵体蛋白点在硝酸纤维素膜上，并用甲醛固定。经封闭液处理并用TBST清洗后，分别加1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000的多克隆抗血清作为一抗，以HRP标记的抗小鼠IgG为二抗，杂交后进行显色试验，检测抗体效价。

1.2.7 Western blot法检测HepG2细胞与抗hABHD16A抗体结合情况 根据以上结果，选取高效价的抗血清，采用Western blot法，以1∶2 000稀释的h ABHD16A多克隆抗血清为一抗，4 ℃过夜孵育，以1∶8 000稀释的HRP标记的抗小鼠IgG为二抗，检测pcDNA3.1-sABHD16A转染HepG2后的表达及抗体结合情况。以转染空载pCDNA3.1的HepG2总蛋白和HepG2的总蛋白为对照，检测抗hABHD16A抗血清与非同源物种ABHD16A的结合活性。

2 结果与分析

2.1 hABHD16A cDNA的PCR扩增与重组pMD19-T-hABHD16A的构建

以hABHD16A cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性条带与预期的1 677 bp相似(图1A)，将该片段回收并连接至pMD19-T载体，经双酶切验证为阳性克隆(图1B)。

A.hABHD16A的PCR电泳结果 M：DL2000 DNA Marker CK：空白对照 1：hABHD16A cDNA扩增产物。 B.pMD19-T-hABHD16A载体双酶切验证； M1：λHind Ⅲ DNA marker M2：DL2000 DNA Marker 1：pMD19T载体 2：pMD19-T-hABHD16A载体双酶切结果A.Agrose electrophoresis analysis of hABHD16A M：DL2000 DNA Marker CK：Control check 1：The PCR amplification product of hABHD16A.B.The restriction enzyme digestion result of pMD19-T-hABHD16A vector M1：λ Hind Ⅲ DNA marker M2：DL2000 DNA Marker 1：pMD19-T vector 2：The restriction enzyme digestion result of pMD19-T-hABHD16A vector.

2.2 ABHD16A序列分析

将测序结果提交NCBI BLAST进行序列比对，比对结果表明与GenBank 上hABHD16A序列相似性100%，将人、猪、鼠的ABHD16A的序列进行比对，发现ABHD16A序列高度保守(图2)，深色区域相似性为100%，浅色和白色区分别为≥50%和≥33%，3个物种的ABHD16A氨基酸序列水平上相似性达到 98.01%，并具有保守的2个GXSXXG 脂肪酶样基序、1个HXXXD功能区和一个活性亲核中心(★表示)。

2.3 pET28a-hABHD16A表达载体构建

将pMD19-T-hABHD16A载体用限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，回收hABHD16A片段连接至pET28a(+)，酶连产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，在含卡那霉素的平板上进行筛选培养，选取单菌落在含卡那霉素的LB培养基中进行扩摇，对从扩摇菌液中提取的质粒进行PCR和双酶切验证。结果显示，表达载体pET28a-hABHD16A构建成功(图3)。将pET28a-hABHD16A质粒转化表达菌株E.coliBL21(DE3)感受态细胞。

图2 哺乳动物直系同源物种ABHD16A结构比较Fig.2 Comparation of the ABHD16A genetic structure with different mammalian orthologous species

A.不同克隆子的质粒PCR M：DL2000 DNA Marker CK：空白对照; 1～4：不同克隆子的PCR验证结果。B.阳性克隆子的双酶切验证 M：DL2000 DNA Marker 1：阳性克隆子的双酶切产物。A. Electrophoretic results of different recon PCR products M：DL2000 DNA Marker CK：Control check 1 to 4：Electrophoretic results of different recon PCR products.B.The restriction enzyme digestion result of positive recombinant elements M：DL2000 DNA Marker 1：The restriction enzyme, digestion result of positive recombinant elements

2.4 重组hABHD16A的诱导表达与纯化

SDS-PAGE结果显示，重组hABHD16A大量表达(图4A)且全部为包涵体形式存在(图4B)，目的条带大小符合预期的Mr63 kD。将表达菌培养在1 L的LB液体培养基中诱导表达，收集菌体，经超声波破碎后离心收集沉淀，对包涵体进行纯化，经反复洗涤3次后，得到纯化的hABHD16A 包涵体2.4 mg(图4C)。按免疫BALB/c小鼠抗原用量分别分装和储存。

2.5 多克隆抗血清的制备与效价测定

本研究共获得4种抗人ABHD16A小鼠血清A1+、A2+、B1+、B2+，同时标记空白对照组血清分别为A-、B-，每预杂交点重组蛋白点样量均为30 μg。点杂交结果(图5A)。结果显示A2+号抗ABHD16A血清的效价最高，效价可以达到1∶5 000 (图5B)。

2.6 抗体结合活性检测

将重组的带有猪ABHD16A cDNA 序列的真核表达载体pcDNA3.1-sABHD16A转染HepG2，48h后，提取细胞总蛋白，检验A2+号抗血清抗ABHD16A的结合活性，Western blot结果显示(图6)，制备的A2+号抗血清能结合细胞内源表达的ABHD16A，同时也能结合外源导入的猪ABHD16A的表达产物，说明所制备的多克隆抗体对于ABHD16A有良好的结合活性。

A.BL21/pET28a-hABHD16A IPTG诱导前后SDS-PAGE M：广谱蛋白Marker 1：BL21/pET28a-hABHD16A未诱导 2：BL21/pET28a-hABHD16A IPTG诱导后。B.重组hABHD16A蛋白的表达分析 M：广谱蛋白Marker 1：BL21/pET28a未诱导 2：BL21/pET28a诱导后 3：BL21/pET28a-hABHD16A诱导破碎后的上清 4：BL21/pET28a-hABHD16A诱导破碎后的沉淀。 C.3次洗涤纯化后包涵体的SDS-PAGE。A.SDS-PAGE electrophoresis analysis of hABHD16A protein expression with IPTG or without IPTG. M：Color Mixed Protein Marker； 1：hABHD16A protein expression without IPTG； 2：hABHD16A protein expression with IPTG.B.Analysis of hABHD16A protein expression. M：Color Mixed Protein Marker; 1：BL21/pET28a protein expression without IPTG; 2：BL21/pET28a protein expression with IPTG; 3： The supernatant fluid of hABHD16A protein expression with IPTG; 4：The sediment of hABHD16A protein expression with IPTGC. C.SDS-PAGE electrophoresis analysis of wash and purification inclusion body three times.

A.4个抗血清效价的测定 B.A2+抗血清效价的进一步测定A.Determination of four antiserum titers B.Further determination of A2+ antiserum titer

M：广谱蛋白marker 1：HepG2细胞转染pCDNA3.1-sABHD16A; 2：HepG2细胞转染pCDNA3.1; 3：HepG2细胞。M：Color Mixed Protein Marker； 1：HepG2 cells transfected with pCDNA3.1-sABHD16A vector； 2：HepG2 cells transfected with pCDNA3.1 vector; 3：HepG2 cells.

3 讨论

研究人员早在20世纪90年代就预测了ABHD蛋白的结构特点和序列保守性，就此被鉴定并命名为ABHD，该家族可能具酯酶等多种活性[1-2,7]。近年来，一些研究人员分别报道了ABHD2[8-11]、ABHD5[12-14]、ABHD6[15-16]、ABHD11[17]、ABHD12[14-15]、ABHD16[3,5,9]和ABHD17[20-21]等可能在脂肪代谢、炎症调节和癌症的发生发展方面发挥作用。作者前期对ABHD蛋白家族和ABHD16A也开展了相关研究[3]，后期将对其分子作用机制开展进一步研究。

采用特异性抗体的结合活性，通过免疫杂交技术，如Western blot和ELISA等方法研究蛋白的活性及其功能是比较常采用而且经典的方法。这些方法依赖于抗体较好的特异性和较高的灵敏度。本研究克隆了人的ABHD16A cDNA序列，并对蛋白结构和序列进行了分析，采用原核表达的重组包涵体蛋白免疫小鼠，制备了高效价多克隆抗血清，首次报道了小鼠抗人ABHD16A抗体的制备，并获得特异性高、高效价抗体，为进一步开展人ABHD16A的相关研究提供了可用的试验材料。

本研究利用原核表达系统能够获得大量目的人ABHD16A蛋白，采用PET系列表达载体可以插入目的基因构成融合蛋白基因在大肠杆菌表达系统中表达蛋白，融合表达系统对蛋白活性影响甚小，但其产量较高，可以制备多克隆抗体等[22-23]。通过纯化包涵体和切胶4次免疫BALB/c小鼠获得了A1+、A2+、B1+、B2+ 小鼠抗人ABHD16A的特异性多克隆抗血清。其中，采用A2+抗血清具有较高的效价，推测可能是未变性的包涵体颗粒增加了免疫原性，及未变性的包涵体之间存在较多的线性抗原表位[24-25]。

Dot blot结果显示1∶5 000稀释所制备的A2+多克隆抗体，仍有较好的结合并识别原核表达后的ABHD16A包涵体蛋白。在HepG2细胞中过表达外源猪ABHD16A，所获得的ABHD16A抗血清采用1∶8 000稀释比例对其检测也具有较好的结合活性，人、猪、鼠3个物种的ABHD16A氨基酸序列水平上相似性为98.01%，这可能是原核表达制备的ABHD16A抗血清具有结合异源蛋白的原因。本研究所制备的抗血清与异源ABHD16A较好的结合活性也为探究ABHD16A在多种哺乳动物中的功能奠定了一定的基础。而对ABHD16A功能及其作用机制的进一步研究不仅有利于揭示其分子机制，而且对于探究新的作用靶标和新型药物发现具有重要意义。