ROC曲线对ECLIA法预测HCV感染的最佳S/CO值的确定和分析*

杨 泽,黎明新

沈阳医学院附属中心医院检验科,辽宁沈阳 110000

丙型病毒性肝炎是严重威胁人类健康的传染病之一,并以血源性感染最为常见[1]。据世界卫生组织统计,丙型肝炎病毒(HCV)在全球范围内的感染率约为2.8%,约有1.85亿人感染HCV[2-3]。因此,对丙型病毒性肝炎的早期检查、及时预防尤为必要。目前,临床上常用的初筛方法就是检测HCV抗体,因其有较高的灵敏度和特异度,而且操作简便、成本低,因此被广泛应用于各大采血机构及临床实验室。研究表明,HCV抗体在早期感染时会存在长达2个月的“窗口期”,但幸运的是这段“窗口期”能随着检测方法灵敏度的提高而缩短,使就诊患者得以早期发现及治疗。正因如此,众多临床实验室逐渐应用了灵敏度高、反应速度快的电化学发光免疫分析(ECLIA)法,但该方法在提高灵敏度的同时,特异度会有所降低,方法学上也就不可避免地出现假阳性的结果,为了保证HCV检测的有效性及准确性,本研究主要针对初筛抗体为有反应性的标本(尤其是弱阳性的标本)进行更特异的补充确证试验,以得出更准确的初筛临界值来完善检测报告,协助临床诊断工作。有研究表明,全国不同地区的HCV感染率有一定差异,以长江为界,北方人群明显高于南方人群[4-5],因此各所实验室都应该有符合当地人群的一个标准初筛临界值。本研究主要目的为完善和确定沈阳地区人群的丙型病毒性肝炎诊断数据。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2017年2月至2018年6月本院门诊和住院患者经过ECLIA法初筛检测HCV抗体有反应性标本(S/CO≥1)167份,阴性标本(S/CO<1)10份,以上标本的收集均按照2004年发布的《丙型病毒性肝炎防治指南》[6]有关标准进行。本研究方案经过本院伦理委员会的批准同意,并且已获得受试者的知情同意书。

1.2仪器与试剂 HCV抗体检测采用罗氏Cobas e 602分析仪(ECLIA法)及配套的HCV抗体检测试剂盒(Anti-HCVⅡ)。HCV RNA检测采用美国伯乐公司的CFX 96 Touch分析仪,试剂为达安基因公司HCV RNA定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。重组免疫印迹试验(RIBA)检测采用重组免疫印迹HCV IgG检测试剂条(MIKROGEN DISGNOSTIK)。

ECLIA法阳性判定:按照罗氏说明书进行判断,S/CO≥1为有反应性。HCV RNA检测:线性范围为1.0×103～1.0 ×107IU/mL,该试剂的灵敏度为250 IU/mL。RIBA法阳性判定:通过显色条带以判定阴、阳性。满足以下任意一条即为阳性,Core 1和Core 2 ≥Cut-off值；Core 1和另一个抗原≥Cut-off值；Core 2和另一个抗原≥Cut-off值；任意3个抗原≥Cut-off值。

1.3方法 将HCV抗体初筛的177份标本根据抗体检测值的高低分为5组,分别是阴性组(S/CO<1)、低值组(1≤S/CO<10)、中值组(10≤S/CO<20)、高值组(20≤S/CO<30)和超高值组(S/CO≥30),将每组依次进行HCV RNA检测,若检测结果为阳性的标本,则诊断为HCV阳性,若HCV RNA为阴性的患者再进行下一步RIBA的补充确证试验,根据显色带的情况进行阳性和阴性的结果判读,若为不确定性的患者可采取定期随访,暂不参与数据分析。若HCV RNA和RIBA补充试验都为阴性的标本,临床上则考虑很大可能为假阳性的标本,通过此方法来确证出真阳性及假阳性的患者,通过数据统计和分析,最终可以得到一个HCV抗体最佳的S/CO值，分析相应的临床诊断意义。

1.4统计学处理 采用Medcalc软件进行受试者工作特征(ROC)曲线的数据分析,计算最佳ROC曲线下面积(AUC),以及相应的灵敏度、特异度、约登指数、最佳临界值等。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HCV抗体的数据收集及结果分析 通过ECLIA法初筛后,检测到有反应性(S/CO≥1)的标本167份,在确证试验时,发现有4份标本HCV RNA检测为阴性的同时,RIBA补充试验也显示为不确定性,因此将不确定的4份标本暂不纳入数据统计,对患者采取定期随访的措施。而本次有效的反应性标本应为163份,与非反应性标本10份,共计173份。

结果为阴性(S/CO<1)的10份标本经HCV RNA及RIBA检测后均为真阴性。有反应性的163份标本经HCV RNA检测可确证的真阳性标本有85份,之后将HCV RNA检测为阴性的标本进一步做RIBA补充试验检测,又检测出45份HCV阳性标本,最终可确诊的血清有130份,约占总标本的75.1%,见表1。

表1 HCV抗体经确证试验后的统计分析

2.2HCV初筛分组结果的数据统计 当1≤S/CO<10时,收集到50份有意义的标本,经过确证为真阳性的标本有17份；剩余的33份均为阴性,因此考虑1≤S/CO<10区间存在很大一部分假阳性的问题,统计结果见表2。

当HCV初筛的S/CO≥10时,共收集113份标本,经HCV RNA检测后确证有81份为真阳性,其余标本进一步做RIBA检测,又检测出32份阳性标本,最终可确诊的血清有113份,阳性率几乎可达到100.0%。

表2 低值组初筛抗体经确证试验后的数据分析

2.3HCV初筛最佳诊断临界值的统计结果 经ROC曲线分析,得到AUC为0.971,最佳诊断临界值为8.83,此时最佳约登指数为0.861,灵敏度为86%,特异度为100%。见图1。

图1 ROC曲线

3 讨 论

HCV抗体检测由于灵敏度和特异度均较高，且标本易获得，操作方法简便、快捷等优点，被临床作为丙型病毒性肝炎筛查的首选方法。在临床工作中,对于“高值组”的标本诊断结果较为明确,但对于“低值组”的弱阳性标本,即处于“诊断灰区”的标本,诊断较为困难，也是临床上造成误诊的主要原因之一。而在临床中,弱阳性标本并不少见,一些自身免疫性疾病或者妊娠的干扰都会导致弱阳性标本的出现。沈阳地区的许多医院都曾出现过丙型病毒性肝炎患者检测结果假阳性的问题,甚至导致医患纠纷的发生。目前，针对HCV抗体检测假阳性的研究相对较少,并且由于不同医院应用的方法及仪器设备不同,因此无法强行统一弱阳性标本的诊断临界值,只能通过大量临床标本的分析确定适合当地人群的最佳诊断临界值。确定适合当地人群的最佳诊断临界值的意义在于既可以增加检验人员审核HCV检测报告的准确性,又能减少因“诊断灰区”带来的临床误诊率及医患纠纷。

本研究收集了10份(S/CO<1)HCV阴性标本,经HCV RNA及RIBA检测后,10份标本均为阴性。由此考虑罗氏Cobas e 602分析仪在检测阴性标本中的特异度较高。但对于S/CO≥1的临床标本,却收集到了33份假阳性标本,约占低值组的66%,由于ECLIA法的高灵敏度，使其能够检测到体内极其微量的抗体,但灵敏度的提高势必也会导致特异度的下降,而特异度的降低必然会造成误诊率的升高,从而不可避免地出现临床上的假阳性患者,临床不得不考虑两者之间的平衡问题。

本研究结果显示,当S/CO≥10时,HCV抗体的真阳性率几乎可以达到100.0%,当1≤S/CO<10时,此区间的真阳性率仅为34.0%,说明在低值组(1≤S/CO<10)中存在相当一部分假阳性患者,而目前来看此区间的阳性率与抗体值的大小并不呈正比，其中1≤S/CO<5的分布最为密集,在36份标本中经过确证发现有26份为阴性,其假阳性率为72%,因此,在检测过程中应格外注意1

本研究将收集到的163份有反应性标本经统计分析后得到ROC曲线,可知AUC为0.971,说明该初筛试验的诊断效果非常好,具有较高的临床诊断价值；在该曲线下,得到最佳S/CO值为8.83,在该点中能够同时确保灵敏度和特异度的平衡；最佳约登指数为0.861,具有说服性。若将本研究得出的最佳诊断临界值应用于临床工作当中,不仅减少了低值组(1≤S/CO<10)的假阳性率,还更具有临床指导意义。

经过统计分析后得知,低值组的数据中不乏众多“假阳性的标本”,若单凭抗体初筛的结果进行诊断治疗,会给临床工作带来很大困扰。考虑到假阳性被检者的体内HCV RNA实际为阴性,属于未患病人群,更不需要用药，因此,应提高报告单的准确性与实用性,通过利用最终的初筛临界值进行更为具体的讨论,并以注释的形式体现在报告单当中,使检验的工作更准确、更完善。对于1≤S/CO≤8.83的标本,建议报告为“有反应性标本”(既不建议报告阳性结果,也不排除有假阳性的可能),并注以该标本的阳性预测值≤95%,建议患者1个月后复查或进行HCV RNA检测,根据核酸定量结果,判断是否为现症感染。

在临床工作中,完善的病毒学检测是对于HCV感染诊断和治疗的基础,2018年11月发布的《丙型病毒性肝炎诊断行业标准》中规定,以HCV RNA结果作为丙型病毒性肝炎临床检测的金标准[7]。同时有数据显示HCV阳性患者每天大约可产生1012copy病毒,因此,可以通过HCV核酸检测以确定是否为现症感染。当HCV抗体检测的值越高,其 HCV RNA检测出的可能性就越大[8-9]。有少数免疫功能抑制的患者体内缺乏HCV抗体,但HCV RNA检测为阳性,基于以上因素,临床上常将定量PCR作为治疗监测、疗效判断的一项重要指标。

由于RIBA试剂盒的价格昂贵，且不能快速得出结果,目前并不适宜国内普遍应用,但考虑其较高的特异度,因此本研究将RIBA作为补充试验,不仅有益于ECLIA法在临床上的初筛，也能对比出不同实验室PCR的灵敏度及检测下限,从而做出调整,以达到符合当地人群要求的检测水平。

2011年我国疾控中心发布的《丙型病毒性肝炎检测技术规范》中有提到,实验室需要根据最佳S/CO值来决定标本是否应进一步补充确证,但由于RIBA的试剂盒成本较高,我国目前对实验室的HCV检测结果并不强行确证。而在实际工作中,考虑到RIBA在特异度上又极具优势,因此本课题小组正在探讨是否应该给予个别弱阳性患者进行临床上的补充确证,以确保检测结果的准确性与完善性。同时,在丙型病毒性肝炎诊断的过程中,除了凭借初筛

抗体检测及核酸定量结果以外,还应多参考免疫、生化等其他指标,为丙型病毒性肝炎患者的早期诊断、及时治疗及预后评估提供更好的临床证据。

目前,国内对丙型病毒性肝炎患者的抗病毒治疗目标是清除HCV,减轻相关损伤,使就诊患者获得治愈，或提高患者的长期生存率及生活质量,同时预防病毒的传播[10]。因此,对于丙型病毒性肝炎的尽早发现、明确诊断和及时治疗尤为重要。根据我国社会发展情况,不同实验室应用的方法学及试剂有所不同,S/CO参考值也会存在差异,所以还应该积极探讨适合于资源有限地区的最佳S/CO值来更好地辅助临床诊断工作。