B(A)02亚型一例分子遗传学特征

孔永奎，孔存权，宋 婕，邵 明，王 莉，刘 欣，杨乾坤，吕先萍

1)郑州大学第一附属医院输血科 郑州 450052 2)河南省人民医院输血科 郑州 450003

因受到抗原、抗体减弱等的干扰，ABO血型血清学试验常常会遇到鉴定困难、表型异常等现象，这些异常现象可由遗传性或继发性因素所致。遗传性ABO表型变异称为ABO亚型，其遗传属性决定了血型鉴定和交叉配血的困难性，在很大程度上影响了救治。若ABO亚型鉴定错误，将大大增加输血风险。目前“精准医学”和“精准输血”理念方兴未艾，分子生物学和分子遗传学在输血医学的应用进一步推动了“精准输血”的发展。ABO基因克隆和测序的完成使得进一步阐明ABO亚型的分子遗传学机制成为可能。现已发现ABO变异型等位基因300多个，其中B(A)亚型等位基因有6个[1]。因比较罕见且缺少群体遗传学的统计，目前B(A)各型等位基因在人群中的分布不甚明了。国内有些研究[2-5]认为B(A)亚型中较常见的等位基因是BA.04和BA.02，这两型通常被认为是遗传学B型，血清学检测结果多表现为AB型，但具体到个体，血清学可能会表现出较大的差异。本文拟通过一例B(A)02亚型的鉴定，来探讨B(A)血型的分子遗传学特征。

1 对象与方法

1.1研究对象患者(即先证者)女，28岁，孕12周，因在当地医院孕检无法确定血型至郑州大学第一附属医院输血科进行血型鉴定。随后采集其父母血样进行血型检测。

1.2血清学鉴定主要试剂包括单克隆抗A、抗B(长春博迅公司)，抗A1、抗H(Sanquin公司)，抗D IgM(珠海BASO)，抗A,B(上海血液生物医药公司)；人源抗A、抗B 为本实验室自制，效价128；Ac、Bc、Oc细胞购自长春博德公司。血型血清学鉴定和操作步骤参照《全国临床检验操作规程》。

1.3ABO基因的扩增和测序采用北京TIANGEN公司的血液基因组试剂盒抽提血样DNA。参照文献[6]建立的方法扩增ABO基因的1～7外显子，扩增结束后取5 μL产物上样到含有GelRed的20 g/L琼脂糖凝胶中，150 V电泳30 min，紫外透射仪下观察扩增是否成功。经酶切纯化后的PCR产物直接作为测序模板，严格按照BigDye试剂盒(ABI公司)说明书操作，用ABI 3730测序仪进行测序。

1.4单倍型分析将PCR产物割胶纯化，用DNA连接酶将第7外显子PCR产物连接到TA克隆质粒pMD18-T中，转化感受态细胞DH5α，摇菌扩增，抽提质粒DNA，测序后进行单倍型分析。

1.5序列的分析和比对采用DNAMAN和Chromas Pro软件进行序列的拼接和比对。ABO等位基因的命名方法参照ISBT血型抗原等位基因数据库。

2 结果

2.1血清学试验先证者及其父母ABO正反定型结果见表1，可以看出先证者与其父存在正反不符，结合血清学试验，认为其表型符合AwB或B(A)亚型。

2.2ABO基因测序对先证者ABO基因1～7外显子及其侧翼序列进行测序，结果显示存在c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.700C>G(图1)、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A杂合突变及c.261delG。参照dbRBC等位基因数据库，通过与A1.01和B.01参考序列比对(表2)，结合单倍型分析确定其基因型为ABO*BA.02/O.01.01，其中的单倍型基因BA.02与B.01相比，多了一个c.700C>G突变，说明BA.02的遗传背景来自于B.01基因。

表1 ABO正反定型鉴定结果

w+：微弱凝集；0：表示不凝集

图1 BA.02第7外显子c.700C>G杂合突变

位点297526657700703796803930ABO*A1.01ACCCGCGGABO*B.01GGTCAACAABO*BA.02GGTGAACA

2.3家系分析先证者为家中独女，祖父母已逝，未采集到先证者兄弟姐妹的血样。测序结果显示，其父基因型为ABO*BA.02/O.01.02，其母为ABO*A1.02/O.01.01，先证者血型基因BA.02遗传自其父(图2)。

图2 家系图

3 讨论

输血前准确鉴定患者血型很重要。ABO亚型常会导致血清学正反定型不一致，给患者输血带来很大的风险。分子生物学和遗传学方法为解决疑难血型鉴定提供了强有力的工具。在遇到因血型亚型、异体输血、父权确认、嵌合体、自身免疫性溶血性贫血等引起的血清学鉴定困难时，可以通过基因测序和家系调查的方法来分析判断[6-7]，结合基因型和表型结果来解释疑难血清学现象。

常见ABO亚型主要有A3/B3、Ax/Bx、Am/Bm、Ael/Bel等，此外还有一大类Aw/Bw亚型，目前没有进行更详细的分类。有研究者[8]提出对于现存4种表型归类困难、出现弱凝集的反应都可以鉴定为Aw亚型，但具体的基因型必须结合分子生物学试验才能最终确定。随着单克隆抗A的应用，B(A)亚型检出率逐渐增高，主要是因为有些厂家的标准血清含有鼠源单克隆MHO4，其作为一种高效价的单克隆抗A试剂能够凝集弱A抗原[2,9]。典型的B(A)亚型主要特点是“B强A弱”，红细胞表面含有几乎正常的B抗原和较弱的A抗原，血清中常含有几乎正常的抗A；倘若是BA基因和A基因共同遗传，B(A)表型则可能由于A抗原的掩盖被判为正常AB型，因此其血清学存在很大的异质性，仅凭血清学试验无法准确判定其基因型。

本例B(A)亚型先证者为一名孕妇，血清学提示其为AwB或B(A)亚型，测序进一步明确了其基因型为ABO*BA.02/O.01.01，家系分析证明其BA.02基因来自于父亲遗传而非自然突变。刘长利等[4]研究认为，B(A) 血型在我国献血人群中的检出率可能是1/(5～10)万，远高于欧洲人种的1/(17～58)万，推测BA.04和BA.02等位基因可能是我国北方汉族人群B(A)血型中的主要遗传类型。金沙等[5]通过筛查大批量上海献血者的cisAB和B(A)血型，发现B(A)血型BA.04和BA.02等位基因频率较高，分别为1.6/10万和0.78/10万，与刘长利等的推测基本一致，提示南方江浙一带汉族人群B(A)血型的等位基因分布与北方相似。目前国际上已报道的BA等位基因有6个，遗传背景都来自于B基因。近年来虽然国内对B(A)的关注逐渐增多[10-13]，但其抗原形成的确切机制还未完全阐明。普遍认为BA基因产物是一种典型的双功能酶，既能够加成大量的UDP-Gal(尿苷二磷酸-半乳糖，B抗原糖供体)，又能够加成少量的UDP-GalNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，A抗原糖供体)到H抗原上，从而使得B(A)红细胞表面既含有B抗原又含有少量A抗原。具体到本例，其较B.01多了一个c.700C>G突变，从而导致第234位氨基酸由Pro突变为Ala。该突变在序列和空间上靠近4个关键氨基酸(第176、235、266、268位的氨基酸)，此4个氨基酸是GTA和GTB的区别所在。邱丽等[14]通过同源建模认为p.Pro234Ala置换影响了第234位氨基酸与Met266分子间的作用力，改变了GTB识别供糖体结合凹槽的结构，使GTB具有部分GTA活性，从而使B(A)血型糖基转移酶具有了双功能酶的活性，能够结合并转移少量UDP-GalNAc至底物H抗原上，导致红细胞膜上形成弱A抗原，从而改变了ABO血型的抗原性。

因为ABO亚型分子机制存在异质性，即相同的表型可以出现不一样的基因型，同一表型可能存在不同的分子遗传机制[15]，因此临床实践中，我们不能仅从血清学表型来直接判断基因型，反之亦然。鉴于本例B(A)02患者体内没有抗B抗体，且又在孕期，如果条件允许，可以采集自体血备用；若身体条件不允许，建议患者生产时备输血可以选用洗涤B型或O型红细胞，血浆、冷沉淀和血小板可以选用AB型。