海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼肉冻融稳定性的影响

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(1.大连工业大学,国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁大连 116034; 2.衢州鲟龙水产食品科技开发有限公司,浙江衢州 324002)

鲟鱼(Acipensersinensis)为冷水性鱼类,是淡水鱼类中个体最大、寿命最长的鱼,是水中的活化石。鲟鱼的主要产品是鲟鱼子酱,其副产物的利用较低。鲟鱼除了体表骨板外,其他部分都可食用,且鲟鱼骨刺少[1],鲟鱼肉中氨基酸含量均衡,蛋白质含量较高[2],非常适合加工。但在冻结贮藏过程中除了易发生冰晶的长大外,由于储藏、运输、加工和销售等环节中温度的不稳定,会出现反复冻融的现象,造成蛋白质变性和脂肪氧化,导致以鲟鱼肉为主的深加工产品非常少。很多研究表明也反复冻融会造成水产品品质的下降,Soottawat等[3]发现反复冷冻-解冻循环波动会造成鳕鱼蛋白质严重变性;Boonsymrej等[4]指出随着冻融次数的增加,虾肉的钙离子ATP酶(Ca2+-ATPase)活力明显降低,肌纤维断裂;反复冻融会使鱼肉中的细胞受到机械损伤,蛋白质变性,解冻时汁液流失量增加,促使脂肪氧化,风味和营养价值下降[5-6],目前添加抗冻剂被认为是防止水产品冷冻变性的最有效的方法之一。

海藻糖理化性质稳定,在人体内易被酶降解为葡萄糖而被人体吸收利用,作为一种新型的抗冻保护剂近年来已用于水产品保藏中[7],有研究表明,海藻糖在生物保护作用比其他糖类具有优越性的主要原因是海藻糖具有优越的玻璃态转变温度(Tg)值,且海藻糖的抑制冰晶的增长速率和冰晶形态学不稳定性比蔗糖更有效[8-9]。苏赵等[10]通过测定冻藏12周冷冻鱼糜的盐溶性蛋白、总巯基、Ca2+-ATPase活力发现添加6%的海藻糖能最大程度抑制蛋白质变性,且鱼糜凝胶超微三维网装结构更为紧实。为了强化鱼类制品的抗冻效果,一般在添加糖类抗冻剂的同时,都会加入复合磷酸盐进行复配[5],单独使用磷酸盐对抑制蛋白质冷冻变性的效果并不明显[11],而复合磷酸盐具有调节pH、乳化、缓冲、螯合金属离子等功能,能够提高肉制品质地、风味和嫩度[12]。以上研究表明海藻糖与复合磷酸盐分别对鱼肉有抗冻变性的效果,但目前海藻糖与复合磷酸盐同时对鱼类制品抗冻效果的研究很少,对其在防止鲟鱼肉冷冻变性的应用研究更鲜有报道。

本研究为了强化鲟鱼肉的抗冻效果,将不同浓度的海藻糖和复合磷酸进行复配,以持水性、蒸煮损失率、硫代巴比妥酸(TBARS)值、Ca2+-ATPase活力为指标,并结合扫描电镜探究复合抗冻剂对鲟鱼肉经反复冻融后鱼肉品质的影响,为鲟鱼肉冷冻调理食品的加工和开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冻藏杂交海博瑞鲟鱼排(达氏鳇和施氏鲟的杂交品种,野生资源分布在中国黑龙江,本研究鲟鱼来源于杭州千岛湖养殖基地,鱼龄8年,体重40 kg左右,打捞月份为每年3～6月份和9～12月份) 衢州鲟龙水产品科技开发有限公司,-20 ℃冷库贮藏;海藻糖 食品添加剂,德州惠阳生物科技有限公司;复合磷酸盐(三聚磷酸钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸二氢二钠、磷酸三钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠) 食品添加剂,天富(连云港)食品配料有限公司;三氯乙酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;硫代巴比妥酸 生化试剂(BC),国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 分析纯,上海生工生物股份有限公司;盐酸 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;超微量Ca2+-ATPase测试盒(型号A070-4) 南京建成生物工程研究所。

CF16RXII高速冷冻离心机 日立(HITACHI);HH-4型数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司;BQPJ-1切片机 嘉兴艾博实业有限公司;200型电子天平 美国双杰兄弟有限公司;UV5200紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;M200型酶标定量测定仪 瑞士Tecan Infinite公司;S8020扫描电镜 日本Hitachi High-technologies公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 冻藏鲟鱼排室温解冻,利用切片机将鱼排切成长宽厚为4 cm×3 cm×3 mm大小的鱼片,然后分别用2.5%、5.0%海藻糖溶液和2.0%、3.0%复合磷酸盐溶液进行复配;按照料液比=1∶1 (g/g)的比例,在0～4 ℃下浸泡60 min,然后在0～4 ℃下将水分沥干,鱼片用保鲜膜包裹后放于-20 ℃冰柜贮藏24 h,用于测定冻融后的持水性、蒸煮损失率、Ca2+-ATPase活力特性、TBARS值和扫描电镜。

1.2.2 持水力测定 参照朱瑞麒[6]方法,将冻融后的鲟鱼片用滤纸包裹,用离心机在3590×g,10 ℃下离心15 min,称重W1。每组样品测定4次,取平均值。计算公式如下:

式中:WHC表示持水率,%;W0表示样品的原始质量,g;W1表示样品离心后的质量,g。

1.2.3 蒸煮损失率测定 将冻融后的鲟鱼片放入包装袋中,在75 ℃水浴锅中蒸煮15 min。蒸煮后流水冷却到室温,用吸水纸将鲟鱼肉表面水分吸干,称重记为W2。每组样品测定4次,取平均值。计算公式如下:

式中:CL表示蒸煮损失率,%;W0表示样品的原始质量,g;W2表示吸水后的质量,g。

1.2.4 TBARS值测定 准确称取冻融1、3、5次的5.00 g碎鲟鱼肉样品,加入25 mL含有15%的三氯乙酸、0.375%的硫代巴比妥酸、0.25 mol/L盐酸的溶液,混合均匀,在沸水浴中加热20 min,待溶液变成粉红色,置于流水中冷却,然后5000 r/min离心20 min,取上清液于538 nm处测吸光度值,以蒸馏水替代样品作空白对照。每组样品测定4次,取平均值。TBARS值根据下面公式计算[13]:

TBARS=7.8×A

式中:TBA以mg(丙二醛)/kg样品计,A表示吸光值。

1.2.5 Ca2+-ATPase活性测定 Ca2+-ATPase活力测定根据超微量Ca2+-ATP酶测试盒说明书进行测定。ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷,测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。以每小时每毫克鲟鱼肉组织蛋白中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmol Pi/mgprot/h)。每组样品测定4次,取平均值。

1.2.6 扫描电镜分析 分别取冻融1、3、5次的样品,用刀片切成3 mm左右厚的小薄片,然后放入密封的小玻璃瓶中,加入2.5%戊二醛溶液,溶液没过样品,然后将样品放入0～4 ℃车载冰箱浸泡48 h,用清水清洗样品,再用10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液清洗,最后用无水乙醇浸泡。然后使用CO2临界点干燥仪进行置换,最后使用扫描电镜观察。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行实验数据统计分析。数据结果为均值±标准差(Mean±SD),采用SPSS 22.0软件(IBM公司)进行显著性分析(P<0.05表示具有显著性差异)。采用OriginPro 8.5软件(OriginLab公司)进行作图。

2 结果与分析

2.1 海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼反复冻融后持水性的影响

由图1可以看出,所有组别的鲟鱼肉在冻融1、2次后其持水性呈下降趋势,但趋势缓慢,在冻融4、5次后持水性显著降低(P<0.05)。经过海藻糖和磷酸盐溶液处理过的鲟鱼肉的持水性下降趋势较对照组缓慢,经过5.0%海藻糖+3.0%复合磷酸盐溶液浸泡过的鲟鱼肉在整个冻融过程中,其持水性能显著高于(P<0.05)未经处理的鲟鱼肉。鱼肉的持水性在冻融1、2次后下降缓慢,在冻融4、5次之后显著下降可能是因为冰晶的形成及生长使细胞膜和组织结构受到机械损害,在解冻初期过程中,肌纤维结构还能维持完整,能吸收一部分解冻后的水分,在冻融后期,随着冰晶的重新形成,肌纤维受到的破坏作用加剧,可能不能再吸收解冻后的水分,持水能力剧烈下降[14]。而经过海藻糖和磷酸盐溶液处理过鲟鱼肉的持水性较对照组高可能是因为海藻糖和磷酸盐能延缓肉蛋白质冷冻变性,因为持水力的下降除了跟肌纤维细胞被冰晶的破坏有关,也与肌肉蛋白质的变性有关[15],而磷酸盐可增加肉的离子强度,提高肉制品的pH,螯合肌肉蛋白中Ca2+、Mg2+,解离肉中的肌球蛋白来提高肉的持水性[16];也有研究指出复合磷酸盐能使蛋白质分子的空间结构增大并容纳更多的水分子,进而增加保水性[17],同时海藻糖具有稳定和干燥蛋白质的功能,也可以有效地保护蛋白质的分子结构,在冷藏或冷冻的过程中防止蛋白冷冻变性[7]。

图1 不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉经反复冻融后的持水率Fig.1 Water holding capacity of sturgeon treatedby different trehalose and composite phosphatesolution after multiple freezing-thawing注:不同小写字母表示差异显著P<0.05;图2～图3,表1同。

表1 不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉经反复冻融后的Ca2+-ATPase活性值Table 1 Ca2+-ATPase value of sturgeon treated by different trehaloseand composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

2.2 海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼反复冻融后蒸煮损失率的影响

由图2可以看出,所有组别鲟鱼肉的蒸煮损失率整体上随着反复冻融次数的增加而增加。经海藻糖和磷酸盐溶液处理过的鲟鱼其蒸煮损失率显著(P<0.05)小于对照组;且在第1、2次冻融时,第2次的蒸煮损失率相对于第1次差异不显著(P>0.05),对于5.0%海藻糖+2.0%复合磷酸盐和2.5%海藻糖+3.0%复合磷酸盐组,其蒸煮损失率在冻融第0、1、2次呈现先上升后下降的趋势。所有组别的鲟鱼肉在第4、5次冻融后的蒸煮损失率显著提高(P<0.05)。经过5.0%海藻糖+3.0%复合磷酸盐处理过的鲟鱼肉在整个冻融过程中的蒸煮损失率最低。有研究者认为蒸煮损失率在冻融处理过程中变化的可能原因是冰晶会消失并重新形成,肌纤维发生径向收缩,肌纤维间出现较大的孔隙,从而使水进入肌肉的通道增加,水合性增加;反复冻融多次后,肌肉细胞结构被破坏,细胞间结合力因反复冻融而减小,在外力作用下肌肉中的水分流出,造成较大的蒸煮损失[18]。

图2 不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉经反复冻融后的蒸煮损失率Fig.2 Cooking loss of sturgeon treated by different trehaloseand composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

2.3 海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼反复冻融后硫代巴比妥酸值的影响

如图3,随着冻融次数的增加,对照组鲟鱼肉的TBARS值显著增加(P<0.05),TBARS值越高,说明脂肪氧化次级产物越多,脂肪氧化程度越严重;其余经过不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉的TBARS值也是随着冻融次数的增加而增大,但氧化程度均小于对照组别。其中经过5.0%海藻糖+2.0%复合磷酸盐和2.5%海藻糖+3.0%复合磷酸盐处理的鲟鱼肉在冻融1、3、5次后的TBA值相对稳定,增长趋势缓慢。鱼肉TBARS值在反复冻融期间的升高与一些研究的结果相同,吴晓等[19]发现草鱼和鲤鱼鱼糜的TBARS值在反复冻融四次之后显著增加,Benjakul等[20]发现鲶鱼的TBARS值在反复冻融过程中反复增加,并认为反复冻融过程中出现融化和重结晶现象,使得冰晶的大小和分布发生变化,会导致细胞膜结构的破坏,造成一些促进氧化组分的释放,特别是血红素铁的释放与脂肪氧化的程度有密切关系。另外,反复冻融过程中会使一些抑制脂肪氧化的抗氧化酶类发生变性,促进了脂肪氧化[21]。经过海藻糖和复合磷酸盐处理的鲟鱼肉其TBARS值小于未处理组别,可能是因为海藻糖可抑制发生脂肪酸败的油脂成分中的脂肪酸的分解[7],且磷酸盐能够螯合肌肉中能激活氧化反应的金属离子,对延缓不饱和脂肪酸氧化有作用[22]。

图3 不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉经反复冻融后的TBARS值Fig.3 TBARS value of sturgeon treatedby different trehalose and composite phosphatesolution after multiple freezing-thawing

2.4 海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼反复冻融后Ca2+-ATPase活性的影响

Ca2+-ATPase活性越高,表明蛋白质冷冻变性程度越低,品质也越好,从表1可看出,所有组别的鲟鱼肉在经过反复冻融1、3、5次后,其Ca2+-ATPase活性都有所下降,表明肌纤维蛋白质都发生了不同程度的变性。对照组鲟鱼肉在冻融1次时,其Ca2+-ATPase活性显著低于(P<0.05)其他组别,为1.215 μmol Pi/mgprot/h,在冻融第5次后,其Ca2+-ATPase活性相比冻融第1次下降了31.2%。而经过复合抗冻剂处理的鲟鱼肉其Ca2+-ATPase活性都高于对照组,特别是经过5.0%海藻糖+3%复合磷酸盐处理过的鲟鱼肉在冻融第1次时其Ca2+-ATPase活性为10.676 μmol Pi/mgprot/h,远高于对照组,说明经过此浓度的海藻糖和复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉能有效防止肌原纤维蛋白质冷冻变性。有研究者[23]认为关于海藻糖的保护机制与糖类分子结构中的-OH基团数有关,基团数越多,对冷冻变性的防止效果也最好,通过改变蛋白质中存在水的状态和性质间接对蛋白质作用,从而防止变性。而关于复合磷酸盐的抗冻机理,普遍认为是复合磷酸盐溶液呈弱碱性,使得鱼肉产品pH维持中性,而肌原纤维蛋白质变性在中性时最小,但也有研究者[24]指出可能是蛋白质分子中的某些基团与磷酸盐中的羟基反应,减少了蛋白质分子之间因官能团反应而产生的聚集变性。

2.5 海藻糖和复合磷酸盐对鲟鱼反复冻融后组织结构的影响

图4为经过不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉在反复冻融后的扫描电镜图。从图4中可以看出,对照组鲟鱼肉在冻融1、3、5次之后,肌肉组织发生明显的变化,肌原纤维出现明显的收缩、排列紊乱和扭曲;肌原纤维之间孔隙变大;部分肌原纤维发生断裂的现象,表明质地发生了严重的劣变。相比之下,经过不同浓度的海藻糖和复合磷酸盐溶液浸泡后的鲟鱼肉在冻融后的肌肉组织变化程度要小于对照组,肌原纤维中除间隙增大,略微扭曲外,基本形状没有被破坏。特别是经过5.0%海藻糖+3.0%复合磷酸盐溶液处理后的鲟鱼肌肉,其组织在冻融5次后基本可以保持原有形状,肌原纤维排列整齐规则,形态完整,保持了较好的质地。鲟鱼肉肌肉组织的变化与肌原纤维的变性程度有关,经过5.0%海藻糖+3.0%复合磷酸盐溶液处理后的鲟鱼肉在反复冻融处理后的Ca2+-ATPase活性最高,肌原纤维变性程度最低,有利于保持完好的形态。

图4 不同浓度的海藻糖与复合磷酸盐溶液处理的鲟鱼肉经反复冻融后的扫描电镜图Fig.4 SEM image of sturgeon treated by different trehalose and composite phosphate solution after multiple freezing-thawing

3 结论

不同浓度的海藻糖和复合磷酸盐溶液可以延缓鲟鱼肉在反复冻融期间持水性的下降、蒸煮损失率的上升、硫代巴比妥酸值的升高和Ca2+-ATPase活性的降低。经过5.0%海藻糖+3.0%复合磷酸盐溶液处理后的鲟鱼肉,其脂肪氧化程度较低,蛋白质变性程度最低,肌原纤维保持排列整齐规则,肌肉组织可保持原有的质地,冻融稳定性最好,可用于鲟鱼肉冷冻调理食品的加工和开发利用。海藻糖和复合磷酸盐对鱼肉感官和风味的影响有待进一步研究,以提高并优化鲟鱼肉产品的品质。