凤凰单枞多酚提取工艺优化及其体外抗氧化和α葡萄糖苷酶抑制活性研究

(肇庆学院食品与制药工程学院,广东肇庆 526061)

凤凰单枞是我国特有的历史传统名茶,产自广东省潮州市凤凰山,由凤凰水仙种中的优异品系单独采摘加工而成[1]。凤凰单枞属乌龙茶类,其栽种历史悠长,品种资源丰富,成茶品质优异,具有“形美、味甘、色翠、香郁”的特点[2-3],深受消费者的喜爱。大量研究表明,长期饮茶可以预防癌症[4]、糖尿病[5]、心血管疾病[6]、肥胖[7]、骨质疏松[8]等慢性疾病,主要在于茶中富含多酚类化合物[9-10]。

茶多酚主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素类和酚酸类物质,具有抗癌、抗氧化、防辐射、防止动脉硬化、提神解乏、护齿明目等功效,并可作为天然的防腐剂和抗氧化剂辅助应用于果蔬、肉制品、乳制品、油脂及糕点类食品等的保鲜及贮藏[11-12]。目前,针对绿茶、红茶中活性成分提取及其抗氧化活性的研究已有广泛报道,也有学者对单枞茶叶的叶片特征[2]、香气成分[3]等进行了研究。近年来,超声波提取技术被广泛应用于植物多酚、黄酮、多糖、氨基酸等天然活性成分的提取。基于超声波的热效应、机械作用和空穴作用,能够加快胞内物质有效溶出,避免长时间高温下活性物质的损失,减少溶剂的使用,实现对目标物环保、高效的提取[13]。

目前,有关凤凰单枞茶中活性成分提取及其功效评价方面的研究工作仍未开展,因此,本研究对凤凰单枞茶多酚的提取工艺条件进行优化,并对多酚提取物的体外抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究,为凤凰单枞价值的充分利用和资源的进一步推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凤凰单枞(蜜兰香型) 购自潮州凤凰镇;芦丁标准品 北京市百灵威科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、阿卡波糖 上海阿拉丁试剂公司;福林酚、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG) 上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、无水碳酸钠、没食子酸、过氧化氢、维生素C、水杨酸等 均为国产分析纯。

DHG-9145A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;HHS-21-6数显式电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;Q-400B固体样品粉碎机 上海冰都电器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-DⅢ循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凤凰单枞茶多酚提取工艺 将凤凰单枞茶于45 ℃烘干至恒重,粉碎后过60目筛,避光密封保存备用。准确称取一定量的凤凰单枞茶粉末样品,按一定液料比在实验设定的温度下超声功率300 W提取一定时间,将粗提液减压抽滤,所得残渣在相同条件下重复提取1次,合并两次提取的滤液,用乙醇定容至100 mL,得凤凰单枞茶多酚提取液。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响 在液料比40∶1,温度60 ℃条件下,按1.2.1中提取流程,分别利用体积分数为60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇超声提取30 min,考察乙醇浓度对凤凰单枞多酚得率的影响。

1.2.2.2 提取温度对多酚得率的影响 以70%的乙醇为提取剂,在液料比40∶1条件下,按1.2.1中提取流程,控制温度为30、40、50、60、70、80 ℃,分别超声提取30 min,考察温度对凤凰单枞多酚得率的影响。

1.2.2.3 超声提取时间对多酚得率的影响 以70%的乙醇为提取剂,在液料比40∶1、温度60 ℃条件下,按1.2.1中提取流程,分别超声提取20、30、40、50、60、70 min,考察超声提取时间对凤凰单枞多酚得率的影响。

1.2.2.4 液料比对多酚得率的影响 以70%的乙醇为提取剂,在温度60 ℃条件下,按1.2.1中提取流程,控制液料比为25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1,分别超声提取30 min,考察液料比对凤凰单枞多酚得率的影响。

1.2.3 响应面试验 在单因素实验的基础上,利用Design-Expert 8.0.6软件对所考察的四个单因素进行Box-Behnken实验设计,优化凤凰单枞茶多酚的提取工艺,响应面实验因素及编码值见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量的测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 按照李卓瓦等[14]绘制标准曲线的方法,稍作修改。配制质量浓度为1 mg/mL没食子酸标准溶液,分别量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述标准液于100 mL容量瓶中,定容后得到没食子酸梯度标准液。量取梯度标准液各1 mL,分别加入5 mL福林-酚试剂,充分混匀,静置5 min,依次加入4 mL 10%的饱和碳酸钠稀释液,混匀后置于室温下反应2 h。以去离子水替代没食子酸溶液作为空白对照,测定反应后的各溶液在765 nm处的吸光度值,每组重复测定3次。以没食子酸浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=0.0142x+0.00317(R2=0.9991),在所选质量浓度范围内线性关系良好。

1.2.4.2 凤凰单枞茶多酚得率计算 参照上述标准曲线的实验步骤测定凤凰单枞茶多酚含量,其得率计算公式如下:

式(1)

式中:C为凤凰单枞提取液茶多酚的质量浓度/(μg/mL);V为多酚提取液的体积/mL;N为稀释倍数;m为凤凰单枞的质量/mg。

1.2.5 凤凰单枞茶多酚抗氧化活性测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 依据参考文献[15],取1.0 mL凤凰单枞茶多酚提取液,加入0.1 mmol/L DPPH 3.0 mL,室温充分摇匀,避光静置反应30 min,于517 nm处测定样品的吸光度A1,用等体积的无水乙醇代替DPPH溶液测得517 nm处的吸光度为A2,用等体积的无水乙醇代替样品溶液测得517 nm处的吸光度为A0。以VC为阳性对照,每组样品平行测定3次,计算相应均值和清除率。清除率计算公式如下:

式(2)

1.2.5.2 羟自由基清除能力 将浓缩后的样品配制成0.20、0.22、0.24、0.26、0.28 mg/mL浓度梯度的溶液。依据参考文献[16],取2.0 mL凤凰单枞茶多酚提取液于20 mL试管中,再依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL,混合均匀放置10 min,再加入6 mmol/L水杨酸2.0 mL,摇匀后于37 ℃恒温水浴反应30 min,以无水乙醇作参比溶液,于波长510 nm处测定其吸光度为A1;用无水乙醇取代水杨酸溶液,测定其吸光度为A2;再以无水乙醇代替样品溶液测其吸光度为A0。以蒸馏水作参比溶液,以VC为阳性对照,每组样品平行测定3次,代入公式(2)计算相应清除率。

1.2.6 凤凰单枞茶多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定 参照Yang等[17]的方法测定凤凰单枞茶多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。利用0.2 mol/L的PBS缓冲液(pH6.8)配制α-葡萄糖苷酶液(0.5 U/mL)和PNPG溶液(3.0 mmol/L)。取50 μL不同浓度的凤凰单枞茶多酚提取物,分别加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液,混匀,37 ℃恒温孵育15 min,再加入50 μL PNPG溶液,于37 ℃恒温反应15 min,加入70 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应,于405 nm波长处测得吸光度为A1。用缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液,测其吸光度为A2;以缓冲溶液代替样品溶液测其吸光度为A0,以阿卡波糖为阳性对照,每组样品平行测定3次,利用公式(2)计算α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.3 数据处理

每组实验均重复3次,结果以均值±标准差表示。采用Excel 2011、SPSS 19.0和Design-Expert V 8.0.6对数据进行整理、分析并绘图,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响 由图1可知,凤凰单枞多酚得率随乙醇体积分数的增加呈先增大后减小的趋势,当乙醇体积分数为70%时,得率达最大值18.15%。原因可能在于乙醇体积分数较低时,一些水溶性物质的溶出影响多酚的溶出;随着乙醇体积分数的增加,提取液极性与多酚极性接近,多酚得率增加;当乙醇体积分数过高时,提取溶剂极性减小,导致部分多酚不能溶出,部分脂溶性组分的溶出也不利于多酚的充分提取[18-19]。因此,乙醇体积分数选择为70%。

图1 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentrationon the extraction yield of polyphenols

2.1.2 提取温度对多酚得率的影响 如图2所示,在30～60 ℃范围内,多酚的得率随着超声提取温度的升高明显增加,在60 ℃时达到最大值18.14%,随后逐渐减小。原因在于,一定温度范围内,分子热运动使得多酚类物质的溶解速度和溶解量随着温度的升高而增加;而多酚是一类多羟基物质,热稳定性差,当温度继续升高超过60 ℃时,易被氧化从而破坏了其结构的完整性[20],导致多酚得率下降。因此,提取温度选择为60 ℃。

图2 提取温度对多酚得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperatureon the yield of polyphenols

2.1.3 提取时间对多酚得率影响 由图3可知,当超声提取时间在20～30 min范围内,由于超声波空化效应的影响,分子运动频率增加、速度加快,溶剂的渗透力增强,以及超声波对细胞的机械振动粉碎作用,使细胞得到快速有效地破碎[13],从而提高了茶多酚溶出效率和溶出量。当超声处理时间为30 min时,茶多酚的得率达到最大值18.12%。此后,随着超声提取时间的延长,多酚得率逐渐下降,可能由于超声振动时间过长对多酚的结构造成破坏[21],导致得率下降。因此,超声提取凤凰单枞茶多酚的适宜时间为30 min左右。

图3 提取时间对多酚得率的影响Fig.3 Effect of extraction timeon the yield of polyphenols

2.1.4 液料比对多酚得率影响 由图4可知,液料比为25∶1～40∶1时,随着提取溶剂用量的增大,多酚的得率增加,原因在于提高液料比可在一定程度上增大细胞膜内外物质的浓度差,促进多酚的溶出。当液料比达到40∶1时,多酚得率为18.08%;之后,随着提取溶剂用量的增大,茶多酚的得率呈下降趋势,可能由于在此过程中有色素、多糖等其他杂质的溶出,从而影响茶多酚的提取效果,导致其得率下降[22]。因此,液料比选择为40∶1。

图4 液料比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratioon the extraction yield of polyphenols

2.2 响应面试验结果

2.2.1 模型建立及方差分析 利用Design-Expert V 8.0.6对实验数据进行多元回归拟合,以多酚得率为因变量,乙醇体积分数、提取温度、超声提取时间、液料比为自变量,建立回归方程:Y=-102.69+2.001A+0.573B+0.244C+1.473D+3.4×10-3AB-2.1×10-3AC+8.5×10-3AD+3.75×10-4BC-3×10-3BD+9×10-4CD-0.018A2-6.106×10-3B2-2.306×10-3C2-0.023D2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis for the regression model

2.2.2 交互作用分析 响应面图的陡峭程度和形状可以直观体现各因素间的联系及交互作用情况。如图5所示,为乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比间的交互作用的响应面图和等高线图。

图5 各因素交互作用对多酚得率的影响Fig.5 Effects of interaction among factors on the yield of polyphenols

由图5可知,乙醇体积分数和提取温度、乙醇体积分数和液料比、提取温度和液料比的交互作用坡面图形状陡峭,且等高线形状均趋于椭圆,说明各因素两两间交互作用显著。乙醇体积分数和提取时间、提取温度和提取时间、提取时间和液料比或响应面图坡面相对平缓,或等高线形状趋于圆形,表明以上各因素间交互作用不显著。

2.2.3 模型的验证 由响应面分析确定凤凰单枞茶多酚提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数69.25%、提取温度56.84 ℃、提取时间34.24 min、液料比42.30∶1，在此条件下茶多酚得率最高达18.22%。考虑到实际提取的可操作性,将预测的最适工艺条件修正为:乙醇体积分数70%、提取温度57 ℃、提取时间34 min、液料比42∶1 (mL/g)。经3次提取实验验证,得到茶多酚得率的均值为18.18%±0.23%,与预测值相差较小,表明模型可靠,优化所得工艺条件可用于凤凰单枞多酚的有效提取。

2.3 凤凰单纵多酚的抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定 由图6可知,凤凰单枞多酚具有较好的清除DPPH·的能力,其半抑制浓度IC50为8.42 μg/mL,清除率大小与多酚质量浓度呈一定量效关系,且整体清除能力优于VC。当凤凰单枞多酚质量浓度在5～20 μg/mL范围内,对DPPH·的清除率随着质量浓度的增加而快速增大;当凤凰单枞多酚质量浓度在20～60 μg/mL范围时,对DPPH·的清除率增加趋于平缓。VC对DPPH·的清除能力随着其质量浓度的增大而逐渐增强,其半抑制浓度IC50为10.38 μg/mL,清除能力低于凤凰单枞多酚;当质量浓度大于40 μg/mL时,其对DPPH·的清除能力(清除率94.0%±1.6%)与凤凰单枞多酚(清除率96.6%±2.2%)逐渐接近。

图6 凤凰单枞多酚对DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging effect ofpolyphenols from Phoenix Dan Cong

2.3.2 羟基自由基清除能力的测定 由图7可知,凤凰单枞多酚具有较强的清除·OH的能力,在实验测定的质量浓度范围内,其清除能力与多酚质量浓度呈一定量效关系,半抑制浓度IC50为24.70 μg/mL。随着质量浓度的增加,凤凰单枞多酚对·OH的清除率持续增大,且高于VC对OH·的清除率。其原因可能在于,凤凰单枞中含丰富的儿茶素单体和多聚体,可提供较多的酚羟基,使其对·OH的的清除能力明显高于VC。当质量浓度达60 μg/mL时,两者对·OH的清除能力相当。

图7 凤凰单枞多酚对羟基自由基的清除作用Fig.7 OH radical-scavenging effect ofpolyphenols from Phoenix Dan Cong

2.4 凤凰单纵多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性分析

由图8可知,凤凰单枞多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有明显的抑制作用,随着多酚质量浓度的增大,其抑制作用不断增强,半抑制浓度IC50为7.24 μg/mL。当凤凰单枞多酚质量浓度达20 μg/mL时,α-葡萄糖苷酶的活性几乎完全被抑制,且凤凰单枞多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用整体显著(P<0.05)高于阿卡波糖(IC50为24.55 μg/mL)。该实验结果与Koh等[23]报道的结果相吻合,原因可能在于,凤凰单枞中的茶黄素对α-葡萄糖苷酶活性起主要抑制作用。当质量浓度达60 μg/mL以上时,凤凰单枞多酚提取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐渐趋近。

图8 凤凰单枞多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.8 Inhibition effect of polyphenolsfrom Phoenix Dan Cong on α-glucosidase activity

3 结论

利用超声辅助提取凤凰单枞茶多酚,经单因素实验和响应面分析优化确定凤凰单枞多酚提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、提取温度57 ℃、提取时间34 min、液料比42∶1 mL/g,该条件下多酚得率达18.18%±0.23%,明显高于茯砖黑茶(多酚提取率5.21%)[24]和白茶(多酚提取率5.65%)[25],表明优化所得工艺条件可有效提取凤凰单枞多酚,具有良好的开发应用前景。抗氧化研究表明,提取所得凤凰单枞多酚对DPPH·和·OH具有较高的清除率,清除能力与其质量浓度呈一定量效关系,其IC50分别为8.42和24.70 μg/mL。在相同质量浓度下,凤凰单枞多酚的IC50均低于对照组VC,表明其抗氧化能力优于VC。抑制α-葡萄糖苷酶活性分析研究表明,凤凰单枞多酚对α-葡萄糖苷酶活性具有显著的抑制作用,IC50为7.24 μg/mL,抑制效果优于对照组阿卡波糖,表明其在餐后血糖控制方面有较好的应用前景。该研究弥补了凤凰单枞多酚提取及体外抗氧化、降糖研究的部分空白,为凤凰单枞资源的充分利用和保健功能的推广提供了参考依据。