巨噬细胞mTOR活化促进小鼠机体有氧糖酵解

刘小琳，柯志勇，宋千成，梁康檐

(南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室，广东 广州 510515)

炎症，是一个基本的生物学过程，其功能主要是使宿主免受病原体的侵害，同时调节已发生损伤细胞的修复和愈合。巨噬细胞在炎症的发生中起着关键作用，它们通过响应其局部细胞因子环境，活化成促炎表型(M1)或抗炎表型(M2)，从而引发对病原体的炎症反应并修复受损组织[1]。研究显示，M1型巨噬细胞可发生类似于癌细胞的糖代谢重编程，表现为糖酵解和乳酸释放增强等特征[2]。在氧气存在与否的条件下，癌细胞主要依赖糖酵解进行代谢，称为Warburg效应，即有氧糖酵解[3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种极其保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以整合各种信号，包括能量、生长因子、营养和应激等，以调节细胞生长、增殖、存活和代谢[4-6]。mTOR主要有两种蛋白复合物组成，mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1主要调控细胞的生长和能量代谢等信号的调节。结节性硬化复合物1(TSC1)是mTORC1信号通路的上游负调节因子，对mTOR的活性有一定的抑制作用[7-8]。糖酵解代谢过程中涉及3个限速酶，其中一个是6-磷酸果糖激酶-1(PFK1)。作为PFK1的变构激活剂的果糖-2,6-二磷酸的产生就是由6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-磷酸酶-3(PFKFB3)催化[9]。 因此PFKFB3可以作为糖酵解过程中的一个重要的信号酶。巨噬细胞mTOR信号通路在小鼠有氧糖酵解的调节中发挥着什么样的作用却不清楚。本文致力于探讨巨噬细胞mTOR活性在有氧糖酵解中的调节作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠(Lysm-Cre TSC1flox/flox)和对照小鼠(TSC1flox/flox)均来自南方医科大学细胞生物学教研室。

1.1.2试剂高脂饲料和普通饲料(参照美国Research Diets公司配方)；葡萄糖(上海麦克林生化科技有限公司)；ELISA试剂盒(Alpco公司，USA)；胰岛素(Eli Lilly公司, USA)；雷帕霉素(Santa Cruz公司，USA)；PFKFB3抗体(Abcam公司，USA)；其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1小鼠的饲养与分组在SPF级动物房饲养小鼠，温度控制在22 ℃，湿度保持在60%左右，12 h光照与12 h黑暗，昼夜交替。我们使用Lysm-Cre TSC1flox/flox小鼠和TSC1flox/flox小鼠分别作为巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠和对照小鼠，并分别命名为KO小鼠和WT小鼠。

1.2.2胰岛素抵抗模型的构建选用4周龄的KO小鼠和WT小鼠，适应性喂养后，高脂饮食12周，作为造模组(HFD)，对照组给予正常饲料(CD)，四组分别命名为CD-KO、CD-WT、HFD-KO和HFD-WT，每周测量并记录小鼠体重。随后对四组小鼠进行葡萄糖糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐受实验(ITT)。

1.2.2.1IPGTT小鼠禁食不进水16 h后，腹腔注射2 mg·g-1的葡萄糖溶液(生理盐水稀释，400 mg·mL-1)，0、15、30、60及120 min后，小鼠尾静脉取血，用血糖仪测定小鼠的血糖值。注射葡萄糖0、15、30、60及120 min后，同时用ELISA方法测定血清胰岛素水平。

1.2.2.2ITT小鼠非空腹，腹腔注射0.8 mU·g-1胰岛素溶液(生理盐水稀释，0.8 U·mL-1)，测定注射0、20、40、60及80 min后小鼠的血糖值。

1.2.3验证实验

1.2.3.1体外验证实验分别取KO小鼠和WT小鼠的原代巨噬细胞，培养至最佳生长期，以5×104浓度的细胞浓度接种于12孔板，细胞贴壁后每孔换成1 mL新鲜培养基或含有雷帕霉素(50 nM)的培养基，每组实验3个复孔。培养4、8和12 h后，用生化分析仪检测葡萄糖消耗和乳酸生成。

1.2.3.2体内验证实验按照2 mg·g-1对小鼠进行雷帕霉素灌胃，连续2周，之后按照之前的方法再进行一次葡萄糖耐量实验。

1.2.4免疫荧光染色取KO小鼠和WT小鼠的肝脏组织，利用免疫荧光染色检测PFKFB3的表达情况。

1.2.5统计学分析采用SPSS 17.0软件进行分析，所有数据用均值±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA法)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1巨噬细胞mTOR活化加剧小鼠的胰岛素抵抗为了研究巨噬细胞mTOR在调节机体胰岛素敏感性中的功能，我们给予WT小鼠和KO小鼠高脂饮食或正常饲料喂养12周。结果显示，与CD-KO和CD-WT小鼠相比，HFD-KO和HFD-WT小鼠的体重均有所增加，但HFD-KO和HFD-WT小鼠之间没有明显差异(图1A)。此外，我们进行了IPGTT和ITT以评估巨噬细胞TSC1缺失在胰岛素抵抗中的作用。在IPGTT中，四组小鼠血糖值均在30 min时达到峰值，HFD-WT小鼠血糖值及血糖升高幅度明显高于HFD-KO小鼠(P<0.05)，CD-WT小鼠血糖值及血糖升高幅度同样明显高于CD-KO小鼠(P<0.05)，HFD-KO小鼠和CD-KO小鼠血糖值无明显差异(图1B)。HFD- KO小鼠血清胰岛素水平远远高于HFD-WT小鼠(P<0.05，图1C)。在ITT中，注射胰岛素后，HFD组小鼠血糖值明显高于CD组小鼠(P<0.05)，同时HFD-WT小鼠血糖值及血糖降低幅度明显小于HFD-KO小鼠(P<0.05，图1D)。以上结果显示高脂饮食造模后，小鼠体重明显增加，并出现了胰岛素抵抗。与WT小鼠比较，KO小鼠出现更加严重的胰岛素抵抗，胰岛素分泌的量也增多。但正常饮食组却没有发现KO小鼠出现胰岛素抵抗。

图1 胰岛素抵抗模型的构建

2.2巨噬细胞mTOR活性对糖酵解的影响结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠的原代腹腔巨噬细胞葡萄糖消耗量明显升高；经雷帕霉素处理后， KO小鼠的原代腹腔巨噬细胞葡萄糖消耗量明显降低(P<0.05，图2A)，乳酸生成同样明显降低(P<0.05，图2B)。对小鼠进行雷帕霉素灌胃后，KO小鼠血糖值明显升高(P<0.05，图2C)。葡萄糖负荷30 min时血糖值达到最高，为21.85 mmol·L-1。结果表明巨噬细胞可通过mTOR信号通路促进糖酵解并产生乳酸，mTOR活性受到抑制后，糖酵解也受到抑制。

2.3PFKFB3在小鼠肝组织的分布免疫荧光染色结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠的肝组织PFKFB3蛋白表达量明显增强(图3)。

3 讨 论

过去数十年，人们发现炎症与糖酵解有一定的相关性，巨噬细胞作为炎症的重要参与成员对糖酵解的调节也有一定的影响，而且与临床上大多数疾病的发生发展密切相关[10]。

在本研究中，我们阐述了巨噬细胞mTOR在葡萄糖代谢中的功能。我们发现，KO小鼠消耗血糖的能力与mTOR活化有关。为了确认巨噬细胞mTOR活性参与糖酵解途径的调节，我们用雷帕霉素抑制mTOR活性，巨噬细胞的有氧糖酵解作用受到抑制。同时，体外实验得到类似的结果，雷帕霉素抑制mTOR活性后，小鼠机体的血糖值明显升高，有氧糖酵解作用受到抑制。为了探讨巨噬细胞mTOR活性如何调节糖酵解，我们取小鼠的肝组织进行荧光染色，发现KO小鼠的肝组织有大量的PFKFB3蛋白表达，该蛋白可以影响2，6-二磷酸果糖水平，进而影响有氧糖酵解通路。因此巨噬细胞可能通过mTOR信号通路调节PFKFB3影响有氧糖酵解途径。

图2 巨噬细胞mTOR活性对糖酵解的影响

图3 免疫荧光染色检测PFKFB3的表达

mTOR信号通路可调节巨噬细胞的亚型(M1/M2)：mTOR活化促进M1型巨噬细胞的极化[11-12]，而M1型巨噬细胞可发生类似于癌细胞的糖代谢重编程。糖代谢重编程是调控M1型巨噬细胞炎症启动的核心事件[10]。研究证实，mTOR信号激活增强HIF-1α基因的表达，M1型巨噬细胞可通过缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白促进有氧糖酵解[13-14]。有研究发现，mTOR信号通路调节PKM2影响食管鳞癌细胞有氧糖酵解[15]，PKM2和本研究中PFKFB3都是糖酵解代谢中的关键酶。通过小鼠胚胎成纤维细胞进行研究，发现mTOR是通过HIF-1α上调PFKFB3的表达[16]， 在人急性髓细胞性白血病细胞中，mTORC1依赖于HIF-1α上调PFKFB3的表达，可以正向调节有氧糖酵解代谢[17]，以上研究结果与本研究结果有异曲同工之处，不同之处在于，本研究是动物体内实验，且本研究不仅在体外细胞实验得到验证，小鼠体内实验也得到了相似的结果。PFKFB3在多种肿瘤组织和细胞中普遍表达，在调节癌细胞的糖酵解过程中其重要作用，通过沉默或者抑制肿瘤细胞中的PFKFB3，可以降低癌细胞的糖酵解代谢[18-20]。以往研究和本研究都证实了PFKFB3与糖酵解的相关性。且本研究证实了在小鼠巨噬细胞中，mTOR通过上调PFKFB3的表达，可以正向调节有氧糖酵解代谢。那么小鼠体内巨噬细胞是否通过mTOR活性改变自身极化状态调节HIF-1α的表达，进一步调节PFKFB3的表达，从而影响有氧糖酵解呢？我们需要更进一步的研究。