固定化微生物技术在富营养化水体修复中的应用

孙 霞，刘 扬，王 芳，谭 岚，张 虎

(1.山东江河湿地生态研究院，山东 济南 271100;2.中国水利水电科学研究院，北京 100038;3.湖南百舸水利建设股份有限公司，湖南长沙 410007)

随着我国工业化和城市化进程加快，大量含氮、磷等营养物质的工业废水和生活污水排入江河、湖泊等水体，导致水生态平衡遭受严重破坏。水利部发布的《中国水资源公报》显示，在2018年所调查的121个湖泊中，中营养湖泊占26.5%，富营养湖泊占73.5%;而2009年调查的71个湖泊中，中营养湖泊占33.8%，轻度和中度富营养湖泊分别占38.0%和26.8%。水质也有所下降，劣Ⅴ类水体面积占比由2009年的 14.0%上升到 2018年的16.1%，人类的清洁优质水资源日益受到威胁。因此如何改善水质和富营养化状况，成为热点问题。

目前处理(修复)富营养化水体的方法主要有物理、化学及生物法，其中以降解污染物为目标的微生物技术由于无二次污染、运行成本低、对周围环境影响小等优势得到广泛关注和应用。然而微生物技术的工业化应用受2个主要因素限制:一是缺乏长期的操作稳定性，二是微生物细胞的分离回收和再利用困难。而固定化微生物技术，即用物理或化学方法将游离微生物细胞限定在某一空间区域内，保持其生物活性，进而可重复循环利用的技术，可以有效克服这些缺点［1-2］。与游离微生物相比，固定化微生物技术具有生物负载量大、稳定性高、对环境耐受性强、不易被流水冲刷等优势［3-4］。近年来，许多学者针对不同的污水性质，采用不同的固定化体系进行大量研究，如将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)固定到海藻酸钙载体中以降解石油废水中的酚类化合物［5］，用藻酸盐凝胶固定微藻(Isochrysis galbana)吸附水中的 Cr(Ⅲ)［3］，将氨氧化菌固定化到海藻酸钙载体中以去除氨氮，且固定化细胞具有更好的保存、循环和生物降解能力［6］。总体而言，固定化微生物技术显示了较强的水处理效果。

虽然目前关于固定化微生物技术的文献很多，尤其是对工业废水污染物的生物降解报道非常丰富，但对富营养化水体中氮磷污染物的处理鲜见全面的综述。为此，笔者重点对富营养化水体修复中固定化载体的选择、固定化微生物细胞的种类以及适用的固定化技术进行综述，试图确定该技术在富营养化水体修复中面临的挑战和今后的研究方向。

1 固定化载体

载体材料的选择是影响微生物固定化效果的重要因素之一，是固定化技术能否投入实际应用的关键。良好的载体材料应具备低廉易得、对微生物无毒、不被生物降解、传质性能良好、能为微生物提供充分的生存空间、易于处理和再生等特性［7］。

目前常用的载体主要有5种类型:无机载体、有机载体、复合载体、改性载体及新型载体(表1)。

表1 固定化载体的分类Table 1 Classifications of immobilization carriers

无机载体包括活性炭、沸石、黏土等，材料廉价易得，但微生物负载量小，易脱落。有机载体包括天然及合成有机载体2类。天然有机载体具有较高的污染物去除率且更环保;合成有机载体具有更好的稳定性和更高的机械强度，但可能对微生物有毒性。海藻酸盐和聚乙烯醇(PVA)是最常用的2类有机材料，如利用海藻酸钠(SA)固定蜡样芽孢杆菌［8］，利用海藻酸钙固定氨氧化菌［6］，利用 PVA 固定硝化细菌［9］等。海藻酸盐作为载体材料的优点是无毒性、渗透性强，能为固定化细胞提供非常温和的环境，在固定化过程中微生物细胞能不受外界条件变化的影响［3］。PVA的优势是价格低廉、容易获得、无毒，氧气和营养物质在PVA载体孔隙中容易扩散，使生物降解更容易完成。复合载体通常是有机载体和无机载体的组合，即将两者的优势互补。如用PVA+SA+生物炭作为载体固定硝化细菌来处理富氨氮水体，结果显示运行72 h时氨氮的去除率可达96.3%，酸碱稳定性和传质性分别提升12.5%和 55.8%，固定化颗粒的破损率降低2.4%［10］。改性载体指在载体加工过程中添加改性物质，或对载体材料表面基团或孔结构进行改性优化，改性后载体和微生物的结合强度增加，生物负载量提高且不易脱落。如用镧/铝改性沸石可以扩大沸石的比表面积，避免孔道被杂质堵塞，增强孔道间连通性，提高沸石对磷的吸附能力［11］。新型载体是具有表面效应、量子尺寸效应以及磁学性质的一类载体。尤其是磁性纳米材料因易于回收、可多次反复利用、应用成本低等优势，受到广泛关注。

近年来，学者们对固定化载体的研究经历了从单一载体到复合载体、从改性载体到新型载体的发展过程，随着材料科学、生物技术以及水处理技术等学科的交叉发展，新型复合载体的开发应用必将成为固定化微生物技术的主要研究趋势。

2 固定化微生物

优良的微生物菌剂是固定化技术的首要条件。目前，许多研究者针对不同污染物选育了大量优势菌株，如降解多环芳烃类有机物(PAHs)的绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红球菌(Rhodococcussp.)、分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)和白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)等［25］，但是针对氮、磷污染物的优良菌种相对较少。表2列举了部分富营养化水体中脱氮除磷的微生物种类。

表2 应用于富营养化水体脱氮除磷的部分微生物种类Table 2 Application of immobilized microorganisms for removal of nitrogen and phosphorus from eutrophic water

传统的生物脱氮理论由氨氧化菌及硝化菌完成硝化过程，继而由反硝化菌将硝态氮、亚硝态氮逐步转化为 N2O和 N2，最终将氮从水体去除［34］。1983年，ROBERTSON 等［35］发现泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)〔后更名为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)〕能同时利用氧和硝酸盐作为电子受体，并提出了异养硝化的概念。与自养硝化菌相比，异养硝化菌具有生长速率快、需氧浓度低、耐酸性强、环境适应性强等优点［36］。随后，研究者发现大多数异养硝化菌也具有好氧反硝化功能［37-38］，于是既具有异养硝化能力又具有好氧反硝化能力的微生物被分离出来，使硝化和反硝化能够同时进行。目前已报道的异养硝化-好氧反硝化菌主要包括副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属 (Rhodococcuus)等细菌，曲霉属(Aspergillus)、黑粉菌属 (Ustilago)、红酵母属(Rhodotorula)等真菌，链霉菌属(Streptomyces)等放线菌以及古菌等［39-40］。

微生物对氮磷的同步去除是富营养化水体处理的主要目标，但在实际脱氮除磷过程中存在硝化菌和聚磷菌菌龄不同、碳源需求竞争等诸多矛盾。1980 年代，OSBORN 等［41］和 BORTONE 等［42］相继发现某些反硝化菌在硝酸盐存在情况下具有吸磷功能，之后学者们陆续发现某些聚磷菌可以利用亚硝酸盐作为最终电子受体进行吸磷，一些兼具脱氮和除磷特性的反硝化聚磷菌被分离出来，使得脱氮除磷同步进行成为可能。已报道的反硝化聚磷菌有不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、副球菌属(Paracoccus)、寡营养单胞菌属(Stenotrophomonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)和肠杆菌属(Enterobacter)等［43-45］。

发挥多种微生物的协同代谢优势，可实现多种污染物同时降解。如固定光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)处理污水，对氨氮、总氮和总磷的去除率最高分别达91.30%、73.51%和 84.88%［46］;固定生丝微菌属(Hyphomicrobium)为主的反硝化菌群处理高浓度含氮废水，对硝态氮的去除率可达92%［47］;用 PVA 固定 EM 菌(effective microorganisms)处理合成废水，对COD和总氮的去除率分别可达 93%和 73%［48］;用 SA固定蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)及光合细菌(PSB)，对磷和氮的去除率分别为84%和95%，且使用固定化菌藻球净化养殖废水比单独使用菌类或藻类效果更好［32］。

固定化微生物细胞的生物降解作用受微生物的菌龄、表面结构、表面电荷、疏水性等自身因素［49］以及pH值、营养物质组成及浓度、无机离子浓度等环境因素［50］影响。固定化微生物细胞必须具有高生物催化活性、细胞的长期稳定性、重复利用的可能性以及固定化过程中活性的低损失性等特性。

3 微生物固定化方法

3.1 吸附法(adsoption)

吸附法是微生物细胞直接和载体接触，然后通过物理吸附、化学键吸附、离子交换吸附等方式黏附和定植于载体［51］。该法被认为是固定化方法中最简单、传统的方法［52］，具有反应温和、简单快速、不需要化学添加剂、载体可重复利用等优点［53］。但由于微生物与载体之间的结合作用力较弱，微生物细胞易从载体上脱落［52］。为了防止脱落，选择合适有效的吸附载体是该法的关键［51］，载体的质地、比表面积、表面电荷等都是判断载体吸附性能的重要依据。此外，细胞的胞外聚合物以及pH值、流速、温度等外界环境都是影响吸附性能的重要因素。

无机吸附材料如活性炭、硅藻土、膨润土、沸石、蛭石等，由于具有较大的孔隙度和比表面积、成本低、易获得等优势，受到广泛关注。朱曦等［28］分别以沸石、火山石、陶环、核桃壳、牡蛎壳为吸附载体处理养殖废水，结果表明沸石对细胞负载量最大，牡蛎壳作为吸附载体降解氨氮和COD的能力较强。吴露等［54］比较膨润土、红壤和炉渣3种吸附载体的除磷特性，结果显示，膨润土吸附量最低，而炉渣吸附量最高。由于膨润土、红壤等无机吸附材料表面没有带电荷的官能团，主要依靠物理吸附，所以存在饱和吸附容量小、易脱落等问题。而炉渣的饱和吸附量及吸附速度优于膨润土和红壤，主要原因是炉渣的Ca、Fe等金属离子氧化物的含量明显高于膨润土和红壤。载体材料中金属氧化物和菌体细胞及水中的离子形成离子交换吸附，使结合力增强，载体材料的磷吸附能力与Ca、Mg、Al和Fe等金属氧化物含量呈正相关［55］。研究发现，金属氧化物和金属有机框架化合物(MOFs)形成的复合材料展现出良好的吸附除磷性能。LI等［56］合成了一种中空磁性 Fe3O4@NH2-MIL-101(Fe)(比表面积为825.15 m2·g-1)，在pH值为7条件下吸附50 min，能够将水体磷质量浓度由0.60降至 0.045 mg·L-1，实现了对磷的快速选择性吸附。

研发高效载体材料是吸附法推广应用的关键。近年来，镧系元素改性吸附材料［11］、酸碱改性吸附材料(Zr-APT)［57］、磁性纳米吸附材料［58］、人工合成吸附材料［59］等改性和新型吸附材料不断研发并应用于富营养化水体除磷，在吸附容量和吸附速度等方面都表现出明显优势。

3.2 包埋法

包埋法分为凝胶包埋(entrapment)和微囊包埋(encapsulation)。凝胶包埋是将微生物固定在载体材料内部，使菌体细胞免受外界环境因子的侵害［51］，是一种不可逆的固定化方法。该法由于操作简单、固定化微球强度高，是目前最常用、研究最广泛的一类固定化技术。但由于包埋过程中微生物要忍耐交联阶段的低温，微生物细胞的活性会受到影响［60］，凝胶包埋会造成传质阻力大，所以适用于底物及产物都是小分子的反应系统，且该方法透气性不好，不适于好氧微生物的固定化［61］。常用作包埋载体的材料如海藻酸盐、PVA、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺等，它们都具有多孔结构，这使得污染物和代谢产物很容易进入载体内部［53］。

微囊包埋是将微生物固定在半透膜的微胶囊中，固定化细胞可在核心空间内自由漂浮，外层 (外壳)由半透膜包裹，形成直径几毫米的微囊结构［62］。半透膜允许小分子营养物质和代谢产物自由进出。而微生物细胞被包裹在膜内，可防止外溢且保护其不受外界环境条件的影响。该技术的优点是不需要对核心材料进行化学改性或修饰，这意味着固定化微生物的活性不受损失［63］。

包埋固定化技术自20世纪70年代开始应用于富营养化水体治理，获得了很好的脱氮除磷效果。WANG等［64］用PVA+SA包埋硝化细菌置于人工湿地中，连续实验结果表明该包埋颗粒对氨氮的去除率为85%，对COD的去除率为73%。唐艳葵等［65］对SA+PVA包埋反硝化聚磷菌群(DNPAOs)的脱氮除磷性能进行探讨，结果发现包埋小球上的菌种多样性较好，固定化体系平均除磷效率为 95.3%，COD去除率为74.9%，氨氮去除率为95.2%。

包埋载体材料的好坏直接决定固定化效率、固定化微生物活性及稳定性等，是影响固定化效果的关键因素。因此许多研究者在包埋载体中加入改性剂，如添加活性炭、累托石、膨润土等，以提高包埋材料的传质性能、机械强度以及包埋微生物的密度、催化活性，从而提高包埋体系的污染物去除能力。庞朵等［66］用SA+PEG作为包埋材料固定异养硝化菌去除水中氨氮时发现，加入适量活性炭后包埋小球的机械强度和小球内的活菌数明显提高。

3.3 共价结合法(covalent binding)

共价结合法是利用细胞表面的官能团和载体表面的反应基团形成化学共价键，从而固定微生物的方法。该法被认为是一种比较经济的方法［67］，也是一种不可逆的方法［68］。通过共价结合使固定化微生物和载体间结合力强，不易脱落，稳定性好［69］，但是该方法操作和控制较复杂，反应条件激烈，对微生物细胞的损伤较大。共价结合法主要应用于酶固定，在细胞固定上应用较少［53］。

3.4 交联法(cross linking)

交联法又称无载体固定法，该固定化方法不利用载体，主要依靠菌体间或通过交联剂使微生物细胞相互结合，形成网状结构。常用的交联剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯和聚乙烯亚胺等。交联固定法具有微生物间结合强度高、稳定性好、细胞密度大、抗外界干扰能力强等优点，但是该固定过程化学反应剧烈，对细胞活性影响大，且交联剂大多昂贵，因此在水处理实际应用中受到一定限制。郑建永等［27］采用聚乙烯亚胺和戊二醛交联法对大肠杆菌的固定化工艺进行研究，发现与游离细胞相比，固定化细胞的酶活性、酸碱稳定性、热稳定性和操作稳定性均有一定程度提高，表明该固定化工艺具有潜在的工业化应用价值。

3.5 联合固定化法(compound immobilization method)

联合固定化法是将2种或2种以上的固定化方法结合，构成新的微生物固定化系统，如包埋-交联法、吸附-包埋法、吸附-包埋-交联法等，该技术弥补了单一固定化方法的不足，在微生物处理性能和处理效果等方面是单一固定化方法的数倍。郑华楠等［10］用SA和PVA包埋固定硝化细菌，添加芦苇生物炭作为吸附材料，利用吸附-包埋固定化方法处理富氨氮水体，结果显示2种方法联合使用有利于基质的运输和扩散，酸碱稳定性和传质性分别提升12.5%和55.8%，固定化颗粒的破损率降低2.4%，72 h内氨氮的去除率达 96.3%。李廷梅等［70］用吸附-包埋法处理河水中氨氮，反应24 h后总氮的去除率均在90%以上，说明该方法可有效应用于河道水质净化系统。朱倩等［9］用PVA和SA包埋硝化细菌处理水体中氨氮，加入交联剂戊二醛后，载体的化学稳定性和微生物的负载量都有所提升，氨氮的去除率可达90%以上。

4 固定化微生物技术在富营养化水体处理中的应用

目前已有膜处理、离子交换、吸附处理、电解处理、化学沉淀等多种污(废)水氮磷的去除方法［71］。学者们针对固定化微生物技术开展了很多探索，该技术显示出显著的脱氮除磷效果。如张焕杰等［26］将分离筛选的高效反硝化菌——斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)用PVA+SA为载体包埋固定，开展人工湿地模拟污水试验，结果显示pH值、温度、DO等外界条件波动对固定化反硝化菌的脱氮效果均小于游离反硝化菌，因此固定化技术可削弱环境因素对人工湿地的脱氮效果。佘梦林等［33］用SA包埋固定具高效聚磷作用的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，处理 10 mg·L-1的含磷废水，12 h可达到排放标准(TP质量浓度＜0.5 mg·L-1)，处理时间比用游离菌缩短一半。除了应用单菌外，也有研究者将2种高效单菌复配以达到同时脱氮除磷。如周跃龙等［72］将高效脱氮菌及除磷菌进行复配，利用PVA进行包埋固定，在模拟河流中对氨氮和总磷的降解率分别达82.7%和79.27%。尹莉等［73］对硝化菌、反硝化菌、除磷菌、COD降解菌等复合菌包埋固定，在模拟装置中考察污染物的去除效果，反应72 h时对氨氮、总氮和总磷的去除率分别为97%、60%和58%，固定化复合菌、粉状菌和液态菌3种菌剂相比较，固定化复合菌的效果最好，且整体成本最低。反硝化聚磷菌的发现使脱氮和除磷同步进行成为可能。慕庆峰等［74］以海藻酸钙作为壁材，用微囊包埋法固定反硝化聚磷菌——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)并应用于湿地水体中，6 h时氨氮质量浓度由5.38 mg·L-1降至检测限以下，硝态氮去除率达98.4%，磷去除率达97.46%，同步脱氮除磷的效果非常显著。

5 固定化微生物技术在富营养化水体修复过程中面临的挑战

5.1 缺乏性能优良的固定化载体

载体是固定化技术规模化应用的关键因素，固定化技术在实际应用中2个瓶颈:一是当前所用的载体价格普遍较高，运行成本较高;二是目前研发的固定化载体半衰期较短，水修复过程中需要频繁更换载体，给运行管理带来不便。因此尽快研发低廉高效、制备简单、寿命长、传质阻力小、生物相容性好的载体材料，是该技术面临的亟待解决的挑战之一。目前研究资料显示，基于纳米材料的新型载体，如磁铁矿(Fe3O4)纳米粒子及其复合磁性纳米材料［75］、氧化石墨烯及其衍生物［76］，由于具有成本低、稳定性强、重复利用率高等优势，成为水处理工业化应用中极具前景的载体材料，需要深入探究其在富营养化水体净化中的应用效果。

5.2 缺乏对固定化微生物的系统研究

富营养化水体是一个复杂的混合体系，污染物成分多种多样，因此需要建立高效的固定化微生物体系，这种体系是使用复合菌剂，还是使用单一高效菌分级处理?固定化材料、固定化方式、固定化条件等对微生物的活性、稳定性、负载量、氧和底物的传质速度等都会产生影响，固定化前后这些指标会发生多大程度的变化?在富营养化水体净化实际应用过程中，如何解决固定化微生物的不稳定性和高敏感性?这一系列问题目前尚缺乏系统研究，也是固定化微生物技术未来需要攻克的重点。

5.3 缺乏适用于富营养化水体修复的固定化反应器

当前，研究者们将固定化微生物技术和污(废)水处理工艺相结合，研发了多种固定化反应器，如填充床反应器用于处理纺织工业废水［77］，生物膜反应器用于处理制药废水［78］和生活污水［79］，流化床反应器用于处理印染废水［80］等，都表现出显著的污水处理优势，得到越来越广泛的应用，但应用于修复富营养化天然水体的固定化反应器研究进展缓慢，因此尽快开发出适合原位修复的高效生化反应器，也是该技术的重要研究方向。

总之，虽然固定化微生物技术在实际应用中还存在一定的不足，但只要确定好方向，通过不断改善和创新，许多不足会逐步解决，该技术必将会在工业化、规模化水处理领域广泛推广应用。