基于细胞穿膜肽的药物递送研究进展

梅隽彦

（华南理工大学 化学与化工学院，广东 广州 510000）

在许多疾病的临床治疗中，药物或显像剂进入细胞的一大阻碍是细胞膜。特别是对于较大的分子和亲水性的分子而言，难以直接穿透细胞膜进入病变细胞进行治疗。细胞穿膜肽（Cell-penetrating Peptides， CPPs）是一类能穿透细胞膜的短链多肽[1]。研究发现，CPPs能够与各种药物分子结合并将药物递送至细胞内，因此CPPs又被称为“生物特洛伊木马肽”[2]。最早的CPPs被发现于1988年，研究人员发现人类免疫缺陷病毒（HIV）的反转录激活因子（TAT）蛋白能穿透细胞膜并有效内化到细胞中[3-4]。随后人们又发现果蝇的转录因子（渗透蛋白，pAntp(43-58)）能够穿透细胞膜进入细胞[5-6]。进一步的研究表明，TAT中起到细胞穿膜肽作用的关键序列为残基49-57[7]。如今，TAT（49-57）及其衍生物已经成为最为常用的CPPs之一。

自1988年CPPs被发现以来，到今天已经有数百种CPPs被文献报道[8]。关于其结构、性质和在药物递送上应用的研究一直是全世界科学家研究的热门课题。截止到目前，CPPs已能在实验室内将各种分子递送到细胞内，如DNA[9]、siRNA[10]、蛋白质[11]、金属配合物[12]、抗癌药物[13]、有机卤化物[14]、造影剂[15]和脂质体[16]等。近年来，科学家们在CPPs的结构、机理，人工设计、合成CPPs以及CPPs的临床应用等研究上均取得了不少成果。本文将从CPPs的分类、CPPs与货物的结合、CPPs内化机制和CPPs的应用四方面加以介绍。

细胞穿膜肽如今成为国内外科学家关注和研究的重要方向。国外近年来都有较为全面的关于细胞穿膜肽研究进展的综述文章，但国内关于细胞穿膜肽的文献较少，一直没有关于其研究进展的较全面的中文综述。本综述参考、引用大量国外期刊上的文献，较为全面地综述了最新的细胞穿膜肽的研究进展。

1 细胞穿膜肽的分类

目前已发现的细胞穿膜肽多种多样，关于它们的分类实际上并没有一个统一的规定。但是，由于CPPs的氨基酸种类和数量在很大程度上决定着它的性质，因此一个为大多数人所接受的分类方法是根据 CPPs的氨基酸序列、疏水性、带电荷情况将它们分为三类——阳离子型肽、两亲性肽和疏水性肽[17]。

1.1 阳离子型肽

阳离子型肽的特点是在生理pH下带有较多的净正电荷，而这些正电荷主要由碱性氨基酸残基（精氨酸，赖氨酸）提供。阳离子型肽在进入细胞时，一般不能引起细胞的应答反应，容易对细胞的活性和完整性造成破坏。研究表明，只有当肽链带正电荷数大于或等于8个时，才能成为有效的CPPs[18]。常见的阳离子型CPPs有：多聚精氨酸以及以多聚精氨酸为模板的CPPs[19-21]、TAT[22]、hLF[23]、(RXR)4[24]等。

科学家们比较了TAT、多聚精氨酸和它们的截短类似物的进入细胞的能力，发现截短类似物进入细胞的能力远远低于正常的CPPs[25]。该结果表明CPPs的性质很大程度上由肽链的氨基酸数量和序列决定。研究指出，阳离子型肽的穿膜性质主要由精氨酸决定[25]。虽然每一个精氨酸残基与赖氨酸残基为肽链提供相同数量的正电荷，但精氨酸残基的作用仍远大于赖氨酸残基。其原因在于，精氨酸残基拥有胍头基团，胍头基团与细胞膜组分中带负电荷的羧基、硫酸根和磷酸盐基团形成双齿氢键的能力强，导致CPPs在生理pH条件下的细胞内化。实际上，仅由精氨酸残基组成的多聚精氨酸就是最简单的CPPs[26-27]。

1.2 两亲性肽

两亲性肽含有亲水结构域（极性区）和疏水结构域（非极性区），往往含有精氨酸、赖氨酸和丰富的疏水残基，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸[28]。根据肽的结构，又可将两亲性肽分为三种：一级结构的两亲性肽，二级结构的两亲性肽和富含脯氨酸的两亲性肽[29]。

一级结构的两亲性肽，其两亲性由它的一级结构直接决定。又分为两类，一类是从天然蛋白质中提取分离的，如ARF(1-22)[30]和血管内皮-钙黏蛋白（pVEC）[31]。另一类是人工合成的，如MPG[32]、CADY[33]和渗透蛋白[34]等。这类两亲性肽一般是将核定位信号区（NLS）和疏水结构域共价连接，例如MPG和Pep-1是分别将HIV糖蛋白和富含色氨酸的簇融合到猴病毒40（SV40）的大T抗原（PKKRKV）上得到的[29]。

二级结构的两亲性肽，其两亲性是由二级结构造成的。二级结构的两亲性CPPs通常呈现独特的α-螺旋结构，并且亲水性残基和疏水性残基分别在螺旋的不同侧[17]，如两亲性MAP[35]、transpotan[36]和p28[37]。或者它们可以在与磷脂膜的相互作用中以β-片状结构呈现，如VT5[17]。富含脯氨酸的两亲性肽，它们都含有脯氨酸吡咯烷模板，比如Bac7[38]。

1.3 疏水性肽

疏水性肽主要含有非极性氨基酸残基，所带的净电荷较低。目前人们只发现了很少疏水性 CPPs，如Pep-7[39]、C105Y[40]和一些化学修饰肽[29]。对于疏水性CPPs的内化机制同样研究得比较少，但有人提出，疏水性肽可以以一种不依赖能量的方式进行细胞内化[41]。

三类细胞穿膜肽的各种性能具体见表1。

表1 部分CPPs序列与分类

（续表1）

2 CPPs的内化机制

已经有很多的实验和报告解释了CPPs的跨膜和细胞摄取机制，但CPPs进入细胞的确切途径的问题还没有完全解决，仍有待进一步的研究。而且，人们发现在实验当中，人为设置的条件会影响实验结果[42]，不同的CPPs进入不同的细胞会有不同的摄取途径，CPPs所带的货物也会对CPPs的内化机制产生影响[43]。目前，主要有两种机制为大众所认同，分别是内吞作用和直接渗透[44-45]。但值得注意的是，CPPs的内化途径并不是固定不变的，许多CPPs能够用多种途径完成内化。而且，CPPs的内化机制还会随着自身浓度、细胞组织、携带货物的不同而产生变化。仍需要更多深入的研究去阐明CPPs的内化机制，这样才能更好得应用CPPs于药物的递送中。

2.1 内吞作用

细胞的内吞作用包括吞噬和胞吞两种，吞噬主要用于吸收其他细胞、病毒或细菌等大颗粒，而胞吞主要用于吸收小颗粒[46]。因此，对CPPs和CPP-货物复合物的吸收主要是胞吞。内吞作用有多种途径，包括巨胞饮[47]（大于500 nm颗粒）、网格蛋白介导的胞吞（90～120 nm颗粒）[48]、脂质筏和细胞膜内陷介导的胞吞（小于60 nm颗粒）[49]以及不依赖网格蛋白或脂质筏的胞吞[50]（60～90 nm颗粒）。早期曾普遍认为CPPs穿膜为非内吞途径，但近年来的研究表明，CPPs的主要内化机制就是内吞。往往有一个或多个内吞途径参与了CPPs和CPP-货物复合物的细胞摄取，而这取决于：①CPPs的性质和二级结构，②CPPs和细胞表面及膜脂组分相互作用的能力，③货物的性质、类型和活性浓度，④细胞类型及膜成分[51]。对于采用内吞作用进入细胞的CPPs和CPP-货物复合物，它们在跨膜后可能不能直接定位于细胞质，而是进入囊泡中[52]。

2.2 直接渗透

除了内吞作用，早期科学家还提出了一些与能量无关的直接渗透途径，如反相胶束模型、打孔模型和地毯模型。反相胶束模型[53]可以解释渗透蛋白等CPPs的转运，但无法解释TAT和多聚精氨酸肽。打孔模型（孔形成模型）[54]用于解释两亲性α-螺旋结构的 CPPs，其外表面疏水残基与脂质膜相互作用形成孔，当肽的浓度高于某一浓度阈值时，内表面的亲水表面形成孔[55]。地毯模型，指内化从肽与带负电荷的磷脂结合开始，然后肽的旋转导致肽的疏水残基与膜的疏水核心相互作用，最后脂质的包装中发生破坏，CPPs得以内化[56]。

许多CPPs能通过直接渗透被细胞摄取，如TAT等富含精氨酸的多肽以及MPG、Pep-1、CADY等[57-58]。

2.3 糖蛋白对CPPs内化的作用

人们一致认为，CPPs与细胞膜糖蛋白之间的初步接触是通过静电作用进行的，大多数CPPs带正电，在细胞表面相互作用的对象一般是带负电的碳水化合物，主要是糖胺聚糖（GAGs）和带负电荷的脂类[50]。研究发现，细胞表面的糖蛋白促进了富含精氨酸的 CPPs的内化[59]，而肝素（HS）、右旋糖酐和一种硫酸化的GAG能抑制细胞对TAT的摄取[60]。另外，清道夫受体（一个糖蛋白家族），也被发现参与了负电荷CPP-货物复合物的内化[61]。

研究表明，对于同一个 CPPs，其内化效率可能因细胞膜的碳水化合物种类的不同而不同，比如肿瘤细胞和正常细胞，肿瘤细胞的膜表面相比于正常细胞发生了很大的变化，对于CPPs的内化也有很大的影响[62]。另外，同一个CPPs的内化途径同样受到细胞膜糖蛋白的影响[63]。研究表明，内吞作用这一途径就强烈依赖于细胞表面GAGs的存在[64]。

2.4 CPPs浓度对其内化的影响

CPPs的浓度同样会对它的内化机制产生影响。许多阳离子型肽CPPs的细胞摄取方式会因CPPs浓度的不同而不同，一般在较高的浓度下（大于10 µM）可能发生直接渗透，浓度足够高时会遵循地毯模型[65]。如TAT和R9在浓度高于一定的阈值时会发生直接渗透[66]。而在低CPPs浓度的情况下，一般以内吞途径进行细胞摄取最为常见。

3 CPP-货物复合物

CPPs与所要递送的货物结合形成的CPP-货物复合物和原来的CPPs有许多相同或相似的性质，这是CPPs能递送药物的基础。对于CPP-货物复合物的合成以及它穿膜并定位于细胞内的过程是现在研究的热点。只有更深入的研究才能利于人们合成出最佳生物功能且能控制它将货物递送到指定位置的CPP-货物复合物。而人们现在所遇到的最大挑战，便是如何精准控制CPP-货物复合物的内化途径和递送位置。

3.1 CPPs与货物的连接方式

CPPs与货物的连接方式有共价连接和非共价连接两种。共价连接是很常用的方式，一般用于中性的货物。将货物和CPPs通过一些可断裂的化学键连接在一起，如二硫键、酰胺键等[50]。也有用一些分子分别于CPPs和货物共价连接，作为“桥梁”将两者黏合在一起。但是，共价连接的一个显而易见的缺点就是形成新键后会破坏货物原本的结构，因此许多货物需要用非共价的方式与CPPs连接。

采用非共价连接的CPPs主要是两亲性CPPs和阳离子型CPPs。一般来说，货物分子相对于CPPs分子来说要大很多，大量的两亲性肽能够通过疏水作用在体液中形成囊泡将货物大分子包裹其中。亲水结构域在外，疏水结构域在内与货物接触。而阳离子型肽则能够通过静电作用，与带负电荷的货物分子在静电力下结合形成CPP-货物复合物。

3.2 CPP-货物复合物的递送过程

关于CPPs与货物分子形成的纳米粒的细胞内化过程，人们提出了肽基纳米粒的形成和内化模型[67]：第一步，CPPs与货物进行共价或非共价的连接；第二步，膜渗透，此时货物可能会影响CPPs的内化途径，且所进入的细胞不同内化途径也可能不同；第三步，CPP-货物复合物在细胞内定位，人们希望在这一步能控制其定位于指定位置（细胞质或细胞核）；第四步，CPPs与货物分离。

CPP-货物复合物在进入细胞后可能会被细胞所形成的内小泡包裹，此时纳米粒必须从内小泡逃脱，否则可能会被溶酶体降解[68]。而关于逃脱的方法人们提出了两种思路：一是纳米粒子与内小泡膜发生疏水和静电作用，导致内小泡被破坏；二是质子海绵理论，内小泡由于渗透压而破裂[69]。

4 CPPs的应用

由于CPPs的穿膜性质，其在对一些难以直接穿膜的大分子药物和显像剂等的递送上有着广阔的应用前景，可能对很多疑难杂症的治疗有帮助。近年来，在前人的基础上，科学家们对于CPPs的应用的有了更深入的研究和更多的尝试，有些已经进入到了临床一期甚至是临床二期的试验。接下来会将其中具有代表性的进行综述。

4.1 肿瘤治疗

癌症已经成为患病率和死亡率都很高的疾病，也是全世界迫切想要攻克的疾病。用CPPs递送抗肿瘤药物能有效提高肿瘤细胞对药物的摄取。但CPPs本身没有特异性，故容易造成脱靶，使全身体细胞均可能摄取抗肿瘤药物。因此，对于科学家们最大的挑战便是如何控制CPPs和其携带的药物只被肿瘤细胞所摄取。为此，科学家提出了一种可激活细胞穿膜肽（Activatable Cell-penetrating Peptides， ACPP）的技术。ACPP指的是先将CPPs隐蔽起来，等到达肿瘤组织时再利用肿瘤组织环境的刺激，使CPPs的穿膜功能恢复[70]。对于ACPP技术的操作方法，人们提出了五种方法。

4.1.1 ACPP 技术的五种方法

方法一是去除“隐身”聚合物来控制CPPs的显示。可以用聚乙二醇（PEG）等亲水性聚合物将CPPs包被使其“隐身”，再利用肿瘤组织的特殊环境使聚合物与CPPs分离，让CPPs显示并恢复对药物的递送[71-72]。该方法又有四种实现方法。第一种是通过pH敏感的腙链接勿与PEG进行功能化，利用肿瘤组织的低pH环境，控制PEG在肿瘤组织中与CPPs分离[73-74]。第二种是通过肿瘤组织中过度表达的酶来分离PEG的包被[75-76]。第三种，是利用阳离子型CPPs与由阴离子嵌段和PEG嵌段组成的二嵌段来合成二嵌段共聚物，二嵌段共聚物之间的离子相互作用能使PEG非共价附着在嵌段上，此时阴离子的pKa仅略低于生理pH，使其电荷在肿瘤酸性环境下被中和，与CPPs分离[77]。第四种是非内源性的PEG切割[78]。

方法二是分子连接臂驱动的触发显示，即分子连接臂驱动CPPs暴露。用嵌段共聚物组成的胶束运载药物。这是一种pH敏感胶束，细胞对药物的摄取对pH改变而改变[79]。

方法三是用离子抑制剂解离控制CPPs。利用CPPs的阳离子特性，用负电荷基团（如带阴离子残基的大小匹配的肽链）与其结合作为抑制剂。该方法又有三种实现方法。一是让CPPs与阴离子肽通过一个包含MMP-2切割位点的肽链相连[80]。二是用与阴离子抑制剂相互作用更强的外源因子取代CPPs[81-82]。三是用外部触发器（如紫外线）将离子抑制剂从CPPs中分离出来[83]。

方法四是利用可电离残基操纵CPPs电荷。用组氨酸残基修饰CPPs，将CPPs电离从一个不活跃的中性状态调到一个活性的阴离子状态[84]。

方法五是温度引发胶束组装对临界CPP残基界面密度的调节。实验表明，CPPs的功能受到精氨酸残基数目的控制，当有六个及以上的精氨酸残基时，CPPs足以被细胞摄取[85]。科学家们认为，控制CPPs的可能不是精氨酸残基的数量而是局部精氨酸残基的密度。因此可以通过温度引发的嵌段共聚物组装成胶束，使精氨酸残基的密度增大，来控制CPPs何时被细胞摄取[86]。

4.1.2 CPPs应用于肿瘤的临床研究

对于CPPs应用于肿瘤治疗的各项技术，有很多已经进入临床或临床前的研究和试验当中。下面举两个实例。

p53蛋白在致癌应激后细胞周期阻滞和凋亡中起重要作用。肿瘤的恶性化取决于由编码p53的基因本身的突变而导致的功能的丧失（这种突变存在于各种人类癌症中），或通过与 p53相互作用的信号通路的损伤[87]。因此，为了，Snyder等[88]开发了一种可转换的、蛋白质稳定的肽RI-TAT-p53C’来恢复肿瘤细胞内p53的促凋亡活性。该化合物由一个反转录D-异构体肽组成，该肽来源于与TAT（47-57）连接的p53的C端调控结构域。RI-TAT-p53C’肽在临床前晚期腹膜癌病和腹膜淋巴瘤模型中的全身性传递导致寿命的显著延长和无疾病动物的产生。

Crombez等开发了一种名为MPG-8（AFLGWLGAWGTMGWSPKKKKRK）的两亲肽载体MPG的优化和缩短版本。这种新的CPP与siRNA形成稳定的纳米粒子，从而提高其体内的释放。这种方法被用于开发靶向细胞周期蛋白B1，这是一种参与有丝分裂的调节蛋白，在各种形式的癌症中表现出改变的表达。在异种移植瘤小鼠模型上，观察局部MPG-8介导的Cyclin B1 siRNA对肿瘤生长的抑制作用。为了提高MPG-8/siRNA颗粒的生物利用度和稳定性，并使其更适合于全身给药，这些颗粒的表面被胆固醇基团功能化。将该功能化化合物静脉注入荷瘤小鼠体内，观察到肿瘤体积明显缩小[89]。

4.2 进行性肌营养不良的治疗

进行性肌营养不良（DMD）同样是用传统方法难以治疗的疾病。而关于将CPPs应用于DMD的治疗，人们已经有了很多的进展并已在小鼠上开展试验，最常见的研究DMD的模型是原发性X-连锁肌营养不良症（MDX）成肌细胞培养物和MDX小鼠。NF-κB被认为是治疗该疾病的一个可能的分子靶点。Peterson等人因此评估了NF-κB的肽抑制剂NBD与AntenNapedia PTD（Antp-NBD）融合在体内的有效性。用这种融合肽腹腔注射MDX小鼠后，其运动性能和部分挽救膈肌收缩能力均有改善[90]。

PMOs是一种无电荷的反义分子，通过阻止翻译或干扰mRNA前剪接，以顺序依赖的方式抑制基因的表达。已在不同的DMD动物模型中测试了与PMO结合的CPPs及其活性[91]。另外，有30%的DMD患者死于心力衰竭。在DMD患者中，首次应用PPMO介导的高效外显子跳跃治疗，提高了对心肌肥厚和舒张功能障碍的治疗效果[92]。

Justin等人利用已有文献报道的64个PMO-CPP共价物的序列建立PMO-CPP库，让计算机对比进行学习，建模并预测一个给定肽是否能作为CPP使PMO活性至少提高3倍。在计算机预测并合成出的7个序列中，经实验测试均为有效CPP，且其中一个优于已有报道的80%CPPs[93]。人们一直很想自行预测可能的CPPs肽序列而不知局限于在自然界中寻找CPPs，Justin的研究不但推动了CPPs在DMD治疗上的应用的发展，还实现了计算机对有效CPPs序列的预测。

4.3 系统性疾病的治疗

雷公藤甲素（TP）是最常见的系统性疾病治疗药物之一。然而TP对不同器官均表现出不同的副作用。为克服其副作用，用细胞穿膜肽R7修饰TP的C-14羧基，得到衍生物TP-二硫-CR7（TP-S-S-CR7）。与游离的TP相比，该衍生物对皮肤具有更低的毒性，可穿过角质层，到达表皮、真皮，能以透皮的方式进行治疗，有望治愈类风湿关节炎等疾病[94]。

4.4 其他疾病的治疗

CPPs在许多疾病治疗上的研究都有取得不错的进展，包括抗菌、抗病毒等[50]。如缺氧缺血性脑损伤[95]、肌萎缩侧索硬化症[96]和阿尔茨海默病[97]等疑难杂症，都被认为能够用CPPs参与治疗。另外，还有研究表明可以利用CPPs治疗角膜移植后的排斥反应[98]。

有一些公司已经研制出了完整的CPP药物并已在临床一期或临床二期的试验阶段。如用于治疗急性心肌梗死的 KAI-1678[99]，用于在白内障手术中减轻眼内炎症和疼痛的 XG-102[100]，治疗颈部肌张力障碍的RT 002[101]。

5 总结与展望

1988年至今，CPPs从被发现到今天一直是科学家们研究的热点之一。人们已经发现了数百种CPPs，并且在它们的结构、性质、穿膜机制上做了很多深入的研究，并能够人工设计、合成CPPs和CPP-货物复合物。同时，科学家一直致力于研究如何将CPPs应用到疾病的治疗中，用于递送药物和显像剂。近年来，特别是在临床应用等方面，对于CPPs的研究又取得了许多突破。但是，到目前为止，仍对CPPs的结构性质，穿膜机制不足够了解，也仍没有CPP药物能够真正投入生产和临床使用。接下来，CPPs仍将是人们关注的焦点，只有把最基础的性质、机理研究清楚了，才更利于去把CPPs应用到疾病的治疗和药物的合成上。而一旦CPP药物成功应用到临床上，包括癌症在内许多疾病的治疗也必获得突破性的进展。