高分辨GC-QTOF MS 法分析烟草中的醛酮类香味成分

闫甜甜，王晓瑜，彭桂新，张峻岭，王宝林，陈 黎，潘立宁，贾国涛，姚 倩，谢复炜*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001 2. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州经开区第三大街8 号 450000

烟草中的醛酮类化合物是一类重要香味成分，与烟草感官品质和风味紧密相关［1］。如，5-甲基糠醛具有甜香，可增加烟气丰满度；β-大马酮具有强烈的玫瑰清甜香气，可赋予烟草特征香气［2］。对国内外烟用添加剂清单、烟用天然香原料的剖析类文献和烟草烟气香味成分定性分析文献［2-5］进行系统调研，发现烟草及烟用添加剂中醛酮类香味成分已超过150 种。因此，建立准确、高通量、快速的烟草醛酮类香味成分检测方法对卷烟产品的开发与维护具有重要指导意义。

气相色谱-质谱联用（GC-MS）作为分析复杂样品中挥发性和半挥发性成分的主要工具，目前已广泛应用于烟草、药物及食品等领域［6-8］；但在分析复杂样品时，可能由于特征离子存在干扰或目标物质量分数低，定性及定量上存在假阳性风险［9］。气相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（GC-QTOF MS）在对目标化合物进行准确定量、快速筛查及未知化合物结构鉴定等方面具有明显优势［10］：一是因TOF 分辨率高、扫描速度快而具有高的质量精确度，通过窄的质量窗口提取，可以排除基质干扰［11］；二是一级全扫描模式数据采集简单方便，不受扫描时间段和扫描离子个数限制，可采集样品全部信息，用于数据存档。在后期数据处理时，可根据不同需要编辑相应的定性定量方法对样品进行分析［12］。文献调研结果表明，目前GC-QTOF MS 的相关研究集中在对农药残留的筛查［13-15］和复杂样品中挥发性物质的定性和定量分析［16-17］方 面。2017 年Chen 等［17］采 用GC-QTOF MS 法对烟叶中115 种农药残留进行了准确定性定量分析。

本研究中通过优化色谱方法、精确质量提取窗口，基于高分辨GC-QTOF MS 构建了烟草及烟草制品中127 种醛酮类香味成分的定量分析方法；并用该方法检测了15 个品牌卷烟烟丝中的醛酮类香味成分，旨在为烟草醛酮类香味成分分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

云南曲靖2016 年产C3F 等级烟叶；15 个市售国产品牌卷烟样品。

QuEChERS 萃 取 试 剂 盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl，美国Agilent 公司）；53 种醛类和74 种酮类标准品（＞95%，美国Sigma-Aldrich 公司、日本TRC公司、北京百灵威科技有限公司、东京化成工业株式会社）；正构烷烃标准品C7～C40（溶剂为正己烷，美国Sigma 公司）；苯乙酮-d8（98 atom% D，美国Sigma-Aldrich 公司）；乙腈（色谱纯，美国J T Baker公司）。

7890A-7200 GC-QTOF MS 气相色谱-质谱联用仪、7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；3-30KS 高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；EOFO-945066 多管式旋涡混合器（美国Talboys 公司）；Quintix 224-1CN 电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

称取2.00 g 烟末样品，加入10 mL 磷酸盐缓冲液调节pH 为3，泡发5 min，加入10 mL 乙腈以及80 μL 30.0 mg/L 苯乙酮-d8内标工作液，以2 500 r/min的转速涡旋10 min，放入-18 ℃的冰箱中冷冻10 min；取出后加入QuEChERS 萃取试剂盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl），再以2 500 r/min 的转速涡旋2 min，7 000 r/min的转速离心3 min；取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 无水硫酸镁，立即以2 500 r/min 的转速涡旋2 min，7 000 r/min 的转速离心3 min；将上清液过0.22 μ m 有机相滤膜，然后分别进行GC-QTOF MS 和GC-MS 分析。

1.2.2 GC-QTOF MS 和GC-MS 分析条件

GC-QTOF MS 分析条件：

色谱柱：DB-5MS UI 弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口端串联预柱（5 m ×0.25 mm）；载气：高纯He，纯度99.999%；恒流模式流速：1.5 mL/min；进样口温度：290 ℃；进样模式：不分流进样；进样量：0.8 μL；升温程序：50 ℃（3 min）5℃/min75 ℃（1 min）1℃/min150 ℃（1 min）2℃/min260℃（1 min）10℃/min290 ℃（10min）。离子源：电子轰击（EI）；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：280 ℃；扫描模式：一级全扫描；质量扫描范围：50～300 amu；采集速率：5 spectra/s。

GC-MS分析条件：

色谱条件同GC-QTOF MS；离子源：电子轰击（EI）；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：280 ℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：33～300 amu；扫描速率：Normal。

2 结果与讨论

2.1 GC-QTOF MS 条件优化

通过对国内外烟用添加剂清单、烟用天然香原料的剖析文献以及烟草和烟气香味成分定性分析文献进行系统调研，购买了139 种醛酮类香味成分标准品。其中甲乙酮、异丁醛等12 种小分子醛酮类香味成分由于稳定性差、灵敏度低等原因需要通过衍生化分析，因此本研究中共对127 种可直接提取分析的醛酮类香味成分进行分析。

采用本实验室已建立的方法对烟草样品进行前处理［18］，对比二氯甲烷和乙腈的提取效果。结果表明采用乙腈的提取效率高于二氯甲烷，如，茄酮、β-紫罗兰酮、樟脑和苯甲醛采用乙腈的提取效率分别为二氯甲烷的4、2、1.5 和4.5 倍。在已建立方法的基础上优化了色谱条件，实现了一次进样对所有目标物的分析。

GC-QTOF MS 能够以精确质量进行数据采集。在进行数据分析时，合适的质量提取窗口可去除干扰离子、提高灵敏度，使定性、定量更加准确，因此，优化了质量提取窗口。在加标1 000 ng/mL的烟草样品基质中，考察了顺-4-庚烯醛、5-甲基糠醛、苯乙醛、反-2-己烯醛、2-萘乙酮和对甲基苯乙酮在不同质量提取窗口下，各化合物的响应面积和信噪比。结果表明，随质量窗口变窄，各化合物响应面积减小，信噪比提高。在质量提取窗口为3 至10 mDa 时，化合物响应及信噪比稳定，且信噪比相对较大。图1a 和图1b 分别为反-2-己烯醛在不同质量提取窗口下提取特征离子精确质量83.049 1 Da 所得峰面积和信噪比值。对于化合物响应较低的情况，以烟草样品中的对甲基苯甲醛（特征离子m/z 120.057 0）为例，比较了质量提取窗口为3 至10 mDa 的色谱图（图2）。质量窗口为5 mDa（图2c）和10 mDa（图2d）时色谱峰峰形较好。综合考虑不同丰度化合物的响应面积和信噪比等因素，质量提取窗口设定为5 mDa。

图1 反-2-己烯醛在不同质量提取窗口下化合物丰度及信噪比Fig.1 Compound abundances and signal-to-noise ratios at different mass extraction windows of (E)-2-hexenal

图2 对甲基苯甲醛在不同质量提取窗口的色谱图Fig.2 Chromatograms of 4-methylbenzaldehyde at different mass extraction windows

2.2 醛酮类香味成分数据库的创建及应用

采用高分辨GC-QTOF MS 对糠醛、β-大马酮等127 种醛酮类香味成分进行分析，创建了烟草中醛酮类香味成分的数据库。该数据库包含每种醛酮类香味成分的高分辨质谱图、保留指数和精确相对分子质量等信息。首先采用高分辨GC-QTOF MS 分析目标醛酮化合物标准品得到其一级全扫质谱图和保留时间，根据保留时间，以正构烷烃系列为参考，计算目标化合物的保留指数，采用Agilent MassHunter PCDL Manager 软件建立醛酮类香味成分数据库。图3a 和图3b 分别为数据库中苯乙醛和水杨醛的质谱图，质谱图中包含各碎片离子的精确离子质量和相对丰度。数据库中其他化合物信息见表1，经验证，各化合物精确质量误差均小于2 mDa。由于该数据库包含每种醛酮香味成分的保留指数和精确特征离子质量，在没有标准品的情况下也可以对醛酮类香味成分进行准确定性，因此该数据库具有广泛的实际应用价值。

图3 数据库中苯乙醛和水杨醛的质谱图Fig.3 Mass spectra of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde in the database

表1 127 种醛酮类香味成分理论质量、数据库中质量、质量误差和保留指数Tab.1 Theoretical masses, measured masses in the database, mass errors and retention indexes of 127 aldehyde and ketone aroma components

表1（续1）

表1（续2）

表1（续3）

在对实际样品进行定性分析时，可通过实际质谱图与高分辨质谱图匹配鉴定醛酮类香味成分。也可使用Agilent MassHunter 定性分析软件中“按分子式查找”对化合物进行定性，设定目标源为建立的醛酮类香味成分数据库，质量提取窗口为5 mDa，进行精确质量提取，以两个以上特征离子准确检出，特征离子丰度比和保留时间/指数与数据库中一致作为定性依据，该定性依据符合欧盟质谱方法定性确证标准［20］。如苯乙醛与水杨醛的保留时间分别为20.55 和20.59 min，其特征离子见表2。在烟丝样品中，保留时间20.59 min 对应的质谱图如图4a 所示，由于水杨醛质量分数低，特征离子质谱丰度低于500（图4b），采用NIST 质谱库匹配时，仅可匹配到苯乙醛。采用定性软件进行查找时，苯乙醛和水杨醛均可准确定性。图5为水杨醛的特征离子提取离子流图，特征离子丰度比与数据库中一致（图3b）。由表2 可知，烟丝样品中干扰离子质量误差小于500 mDa，采用传统GC-MS 提取时无法去除干扰离子，高分辨GC-QTOF MS 法定性更加准确。

表2 苯乙醛和水杨醛的特征离子信息Tab.2 Information of characteristic ions of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde

图4 在烟丝样品中保留时间20.59 min 处峰的质谱图和水杨醛的特征离子质谱图Fig.4 Mass spectra of peak and characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde at retention time 20.59 min in cut tobacco sample

图5 在烟丝样品中水杨醛的特征离子提取离子流图Fig.5 Extracted ion chromatograms of characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde in cut tobacco sample

2.3 GC-QTOF MS 定量分析

GC-QTOF MS 能够以精确质量进行全扫描并通过窄的质量窗口提取去除干扰离子峰、提高信噪比，使定量结果更加准确。通过对比樟脑和2-乙酰基-5-甲基呋喃在传统GC-MS 与高分辨GC-QTOF MS 条件下的提取离子流图，证明采用GC-QTOF MS 法通过窄的质量窗口提取可提高灵敏度，去除干扰离子。烟草样品中樟脑（特征离子m/z 98.085 5）的保留时间为31.03 min，图6a 是传统GC-MS 提取质量数95 Da 的离子流图，由于背景噪音过大，无法识别化合物信号。在GC-QTOF MS 全扫描条件下，设定质量提取窗口为±500 mDa时，化合物信噪比小于3（图6b）。当质量提取窗口缩小到±5 mDa 时，信噪比明显提高（图6c）。烟草样品基质中2-乙酰基-5-甲基呋喃（特征离子m/z 109.028 4）的保留时间为20.60 min，图7a 为传统GC-MS 提取质量数109 Da 的色谱图，在其右侧出现较大干扰峰。以±500 mDa 质量窗口提取的色谱图（图7b）与传统GC-MS 色谱图一样有较大干扰。图7b 中1#色谱峰的质谱图如图8a 所示，基质中2-乙酰基-5-甲基呋喃的特征离子精确质量为109.027 3 Da。2#干扰峰中干扰离子的精确质量为109.059 3 Da（图8b），与目标离子精确质量109.028 4 Da 相差30.9 mDa，当质量提取窗口为±5 mDa 时，可去除干扰离子109.059 3 Da（图7c），使定量更加准确。

在对目标醛酮类化合物进行定量分析中，质量提取窗口为±500 mDa 时，2,2,6-三甲基环己酮、2,3-二甲基-2-环戊烯-1-酮等12 种目标醛酮化合物存在干扰。当质量提取窗口为±5 mDa 时，可以去除干扰，实现对目标醛酮准确定量分析。

图6 樟脑在GC-MS 和GC-QTOF MS 全扫描模式下提取的离子流图Fig.6 Extracted ion chromatograms of camphor by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

图7 2-乙酰基-5-甲基呋喃在GC-MS 和GC-QTOF MS 全扫描模式下提取的离子流图Fig.7 Extracted ion chromatograms of 2-acetyl-5-methylfuran by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

图8 图7b 中1#和2#号色谱峰的质谱图Fig.8 Mass spectra of 1# and 2# chromatogram peaks in Fig.7b

2.4 GC-QTOF MS 定量分析方法的建立与表征

为了减少基质效应［18］对醛酮类香味成分定量的影响，采用基质匹配标准溶液进行标准曲线的绘制，实验过程中均以5～7 个标准浓度点绘制标准曲线，基质添加标准溶液浓度范围见表3。由于巨豆三烯酮、金合欢基丙酮等标准品为同分异构体混合物，在定量分析中将同分异构体合并计算。以苯乙酮-d8为内标校正仪器响应，考察低、中、高3 个水平的加标回收率和日内精密度，并在中添加水平下进行日间精密度（n=6）考察，以10倍信噪比作为方法定量限。线性范围、加标回收率、定量限（LOQ）和日间精密度见表3。结果显示，127 种醛酮类化合物均具有良好的线性关系（r2＞0.99）。3 个添加水平下，平均回收率在61.8%～132.6%间，相对标准偏差（RSDs）（n=5）均小于20%，在低、中添加水平下，辛醛、苯甲醛、对甲基苯甲醛的平均回收率高于120%，十一醛、麝香酮等9 种化合物的平均回收率低于70%。可能由于目标化合物数量较多，实验中采用单一内标校正，无法保证所有化合物的分析条件均为最佳条件；此外，在浓度较低时，部分化合物存在吸附现象。所有化合物的日间RSD（n=6）均小于20%，其中115 种化合物的日间RSD 小于10%。有95 种醛酮化合物的LOQ 在6～100 μg/kg 之间，21 种化合物的LOQ 在100～500 μg/kg 之间，11 种化合物的LOQ 在500～5 000 μg/kg 之间。该方法线性关系、回收率和精密度均良好，可满足实际卷烟烟丝样品中半挥发性醛酮类香味成分的分析。

由于GC-QTOF MS 法需要以精确质量扫描样品中全部离子，与进行选择性离子检测的传统GC-MS法的SIM模式和GC-MS/MS 法的MRM 扫描模式相比，灵敏度较低［16］。对比63 种醛酮类化合物的定量限（表3），可知GC-MS/MS 的MRM 扫描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有62 种，而GC-QTOF MS 全扫描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有49 种。

表3 127 种醛酮类化合物的线性范围、回收率（n=5）、日间精密度和定量限①Tab.3 Linear ranges, recoveries (n=5), inter-day precision (RSDs) and limits of quantification (LOQs)of 127 aldehyde and ketone compounds

表3（续1）

表3（续2）

2.5 卷烟烟丝样品分析

采用已建立的方法对国内15 个品牌卷烟烟丝样品的分析结果见表4。15 个品牌卷烟烟丝共检测到63 种醛酮类香味成分，包括22 种醛和41 种酮。3-庚烯-2-酮、邻甲基苯甲醛、对甲氧基苯乙酮等可能由于在烟丝中的质量分数低于本方法定量限而未检出。定量结果显示，卷烟烟丝中质量分数最高的是茄酮，其次是巨豆三烯酮、苯乙醛和糠醛。59 种醛酮类化合物在15 个品牌卷烟烟丝中均有检出，其中不同品牌中烟酮、苯甲醛等14种成分质量分数的最大值为最小值的两倍以上。乙基香兰素、乙基麦芽酚、乙基环戊烯醇酮和紫苏醛4 种化合物可能为添加的香味成分，仅在部分样品中有检出，其样品数分别是7、11、3 和2 个。

乙基香兰素在1#～4#、10#、12#、13#号样品中有检出，质量分数在0.15～0.65 mg/kg 之间。乙基环戊烯醇酮仅在1#、2#和11#号样品中有检出，质量分数分别为1.84、2.75 和0.63 mg/kg。紫苏醛仅在8#和9#号样品中有检出，质量分数分别为0.96 和0.80 mg/kg。乙基麦芽酚在1#～11#号样品中有检出，质量分数在0.16～33.8 mg/kg 之间，8#和9#号样品中质量分数分别为23.2 和33.8 mg/kg，其他样品中质量分数均低于3.81 mg/kg。从以上结果可知，不同卷烟烟丝样品在加香加料方面有差异。

表4 15 个不同品牌卷烟烟丝中醛酮类香味成分分析结果①Tab.4 Analysis results of aldehyde and ketone aroma components in cut tobacco samples of 15 cigarette brands

3 结论

①基于高分辨GC-QTOF MS 建立了127 种醛酮类香味成分的数据库和准确定量分析方法，与传统GC-MS 全扫描模式相比，GC-QTOF MS 通过精确质量提取可去除干扰离子，提高灵敏度，实现烟丝中醛酮类香味成分的准确分析。②由于GC-QTOF MS 需要以精确质量扫描样品中全部离子，该方法比GC-MS/MS 的MRM 模式灵敏度低。③该方法具有高通量、定性定量准确等优点，可用于烟草中醛酮类半挥发性香味成分的分析。