基于超声微波协同萃取法的仙人掌果皮黄酮提取工艺

于淑池,肖陈媛

(海南热带海洋学院 食品科学与工程学院,海南 三亚 572022)

0 引言

仙人掌为双子叶植物,在我国海南岛及广东雷州半岛一带大量生长,仙人掌果具有活化淤血、祛除湿气、退热清热、生肌、消肿、强健胃脾、止痛凝血等多种功效[1].仙人掌果肉含有氨基酸、维生素、多糖类物质、矿物元素等营养成分,特别是黄酮类物质含量丰富[2-3].其果皮由于毛刺多,不便食用而长期未被开发利用,仅民间作水果食用[4].目前对仙人掌黄酮的提取多集中在可食用仙人掌[5]、仙人掌花[6]、仙人掌全果[7-9]等,仙人掌果皮黄酮的提取研究还未见报道.黄酮类物质传统提取方法主要有水提法、醇提法、碱提法和其他有机溶剂萃取法[10],超声微波协同萃取法是一种工艺简便、提取成本低、节约能源、提取率高的技术[11],本研究采用超声微波协同萃取辅助乙醇提取技术提取仙人掌果皮中的黄酮,为仙人掌果皮的废物利用,提升仙人掌果的经济价值,促进仙人掌果的全面开发利用提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料:仙人掌果,产地为海南三亚,购于三亚市胜利路旺豪超市;芦丁标准品(UV≧98%);溴化钾光谱纯;硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇(95%)均为分析纯.

1.2 实验仪器

LT-DBX23N型热风循环烘箱(立德泰勀上海仪器有限公司);RS-FS1401型电动食品加工机(合肥荣事达小家电有限公司);MultifugeX1R型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司);XO-SM200型超声波微波化学反应器(南京先欧仪器制造有限公司);T6型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher);FA2204B型电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司);SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RE-52型蒸发旋转仪(上海亚荣生化仪器厂);Pilot7-12E型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

配置芦丁标准溶液,称取5 mg芦丁标准品,然后溶解于55%乙醇中,定容至50 mL,由此得到的芦丁标准溶液,其浓度为0.1 mg·mL-1.精确吸取芦丁标准溶液:0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于6支比色管中,向不同浓度比色管中按顺序加入0.6 mL 5%的NaNO2,摇晃均匀后静置5 min,再加入0.6 mL 10%的Al(NO3)3,摇晃均匀后再静置5 min,随后加入8 mL 4%的NaOH,加入55%乙醇至比色管25 mL刻度处,摇匀静置10 min后于510 nm波长处测定吸光度,试剂空白参比[12],从而得到芦丁标准线性回归方程:y=0.523x-0.000 2,其中x代表芦丁浓度(mg·mL-1),y为吸光度值,R2=0.991 5,拟合度高,线性关系较好.

1.3.2单因素及正交试验

仙人掌果皮烘干粉碎,过70目筛,采用超声波微波协同萃取法,以黄酮提取量作为指标,分别称取1.0 g仙人掌果皮各5份,初步固定微波功率300 W、超声波功率480 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇浓度65%、提取时间40 min、提取温度60 ℃,展开微波功率(0、100、200、300、400 W)、超声波功率(240、360、480、600、720 W)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g·mL-1)、提取液乙醇浓度(45、55、65、75、85%)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、提取温度(40、50、60、70、80 ℃)6个因素单因素试验,在单因素试验此基础上,选取对仙人掌果皮黄酮提取量影响较大的4个因子进行L9(34)正交试验,因素水平见表1.

表1 正交试验因素水平表

1.3.3 光谱扫描

1.3.3.1紫外-可见吸收光谱扫描:仙人掌果皮黄酮溶液在230～600 nm波长范围内进行扫描,观察并分析其特征吸收峰.

1.3.3.2傅里叶变换红外光谱扫描:采用压片法[13],称取适量的仙人掌果皮黄酮样品粉末和适量的溴化钾粉末,其中样品含量约为总含量的2%,混合后于玛瑙研钵中红外灯光的照射下进行研磨,然后压片,在400～4 000 cm-1波数范围内进行光谱扫描.

1.4 数据处理

分别采用Excel和Origin7.5绘图,显著性差异采用Duncan多重比较检验分析(P<0.05),黄酮提取量的计算,测定仙人掌果皮黄酮提取液吸光度值,根据芦丁标准曲线方程计算仙人掌果皮提取液浓度,按如下公式

(1)

计算黄酮提取量(mg·g-1)，其中:X为仙人掌果皮黄酮浓度(mg· mL-1);M为称取样品质量(g);V1为提取液体积(mL);V2为吸取样液体积(mL);V3为定容体积(mL).

2 结果与分析

2.1 单因素实验的结果与分析

2.1.1 微波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

图1 微波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定超声波功率480 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇浓度65%、提取时间40 min、提取温度60 ℃,测定不同微波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,按着公式(1)计算黄酮提取量,结果见图1.

图1显示仙人掌果皮黄酮的提取量先升高后减少,微波功率达到200 W时,总黄酮提取量最高为10.41 mg·g-1,这种现象可能由于提取初期微波功率为零,只有超声波作用,然后随着微波功率开始增大,果皮细胞会被微波辐射损坏,这促进了黄酮类化合物的溶解;但是当微波功率继续增大后,使得局部温度也逐渐开始升高,导致了细胞结构被破坏[14],从而导致黄酮结构的破坏,进而使提取量减小.由此得出,提取仙人掌果皮黄酮的最佳微波功率为200 W.

2.1.2 超声波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

图2 超声波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定微波功率200 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇浓度65%、提取时间40 min、提取温度60 ℃,测定不同超声波功率对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,结果见图2.

图2显示仙人掌果皮黄酮提取量的变化趋势为逐渐增加后减少.当超声波功率达到600 W,黄酮提取量最高可以达到9.48 mg·g-1.这是因为随着超声波功率逐渐增加,由于超声波的作用使得细胞内的黄酮连续溶解,超声波功率再继续增大,过大的超声波破坏了细胞壁[15],从而使得黄酮的提取率越来越少,超声波功率再继续增大会继续使仙人掌果皮细胞组织破碎变形,此时黄酮几乎全部被提取出来,提取率也不再增加.所以提取仙人掌果黄酮最佳的超声波功率为600 W.

2.1.3 提取时间对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

图3 提取时间对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定微波功率200 W、超声波功率600 W、料液比1∶15 g·mL-1、乙醇浓度65%、提取温度60 ℃,测定不同提取时间对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,结果见图3.

图3显示,黄酮的提取量随着提取时间的推移逐渐增大然后再减小.当提取时间达到30 min时,黄酮提取量达到最大为7.07 mg·g-1.提取的时间越长黄酮提取量越少,这可能是因为随着时间的推移,微波和超声波二者对类黄酮的破坏作用产生叠加效果,破坏了黄酮的稳定性,从而黄酮提取量也迅速减少.因此,仙人掌果皮黄酮的最佳提取时间为30 min.

图4 料液比对与仙人掌果皮中黄酮提取量的影响

2.1.4 料液比对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定微波功率200 W、超声功率600 W、提取时间30 min、乙醇浓度65%、提取温度60 ℃,测定不同料液比对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,结果见图4.

由图4可知,当料液比为1:10(g·mL-1)时,提取量达到最大9.38 mg·g-1.这是因为仙人掌果皮内所含黄酮量不比果肉那样丰富,当料液比为1∶10(g·mL-1)时萃取剂已经很充足,使得细胞到达一个动态平衡的状态,物质快速溶解流出,黄酮的提取率达到最高值,然后料液比再继续增大,除黄酮外的其他杂质也能溶解于乙醇当中,这会导致黄酮的提取率的减少.所以,提取仙人掌果皮黄酮的最佳料液比为1∶10(g·mL-1).

图5 提取温度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

2.1.5 提取温度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定微波功率200 W、超声功率600 W、提取时间30 min、料液比1∶10 g·mL-1、乙醇浓度65%,测定不同提取温度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,结果见图5.

图5显示,温度为60 ℃黄酮的最大提取量为6.83 mg·g-1,初期,黄酮在乙醇中的溶解度会跟着温度的升高而增加,提取剂的扩散系数也在跟着温度的升高而增加,这促使了提取速度的加快,过高的温度会对细胞结构造成破坏[16],也容易氧化黄酮类化合物,并且其他杂质物质也逐渐增多,所以,仙人掌果皮黄酮的最佳提取温度为60 ℃.

2.1.6 乙醇浓度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

图6 乙醇浓度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响

固定微波功率200 W、超声功率600 W、提取时间30 min、料液比1∶10 g·mL-1、提取温度60 ℃,测定不同乙醇浓度对仙人掌果皮黄酮提取量的影响,结果见图6.

如图6所示,当提取剂乙醇的浓度为55%时,黄酮的最大提取量达到9.15 mg·g-1.黄酮提取量随着乙醇浓度的增大,过高浓度的提取剂中黄酮类化合物不能充分溶解[17];另一方面是因为过高浓度的酒精使细胞中蛋白质凝固,凝聚堵塞组织微孔,阻碍了黄酮的溶出,故提取率下降[18],试验结果表明乙醇的浓度优选为55%.

2.2 正交实验的结果与分析

选取单因素中对黄酮提取量影响较大的微波功率、超声功率、乙醇浓度、料液比进行L9(34)正交试验,结果见表2.

表2 正交试验结果

极差分析结果表明,四个因素影响实验的幅度排列顺序为D>C>B>A,仙人掌果皮中黄酮类物质的最佳提取条件为A2B1C3D1,即:微波功率为200 W时,超声波功率设置为480 W,乙醇浓度为60%,料液比为1∶8(g· mL-1),经验证实验,在此条件下仙人掌果皮黄酮的提取量为14.73 mg·g-1.

2.3 光学性质研究的结果与分析

2.3.1 紫外-可见吸收光谱扫描

仙人掌果皮黄酮紫外-可见光谱扫描结果见图7.

图7 仙人掌果皮中黄酮的紫外-可见光谱扫描图

通常,大部分的黄酮类物质在紫外-可见吸收光谱扫描中会出现两个主要的特征吸收峰,峰I的具体波长范围为300～400 nm,这一吸收峰的产生主要是由于黄酮类化合物基本结构中的黄酮B环和环肉桂酰系统,峰II 的具体位置为200～285 nm,该吸收峰主要是由于黄酮类化合物基本结构中的黄酮A环和侧链苯甲酰系统引起[19].图7显示,仙人掌果皮中黄酮物质主要出现了两个吸收峰带,峰I的吸收峰处于330～380 nm之间,峰II的吸收峰处于235～250 nm之间,这两个吸收峰带与标准品芦丁相似,符合黄酮类化合物的两个特征吸收峰波长范围内.其中吸收峰II更强,峰I的吸收峰较峰II更宽且缓,这说明仙人掌果皮中黄酮类化合物的黄酮B环和环肉桂酰系统上的取代基成分种类较多.

2.3.2 红外光谱扫描

仙人掌果皮黄酮红外光谱扫描结果见图8.

图8 仙人掌果皮黄酮红外光谱扫描图

由图8可知,仙人掌果皮总黄酮和芦丁标准品在400～4 000 cm-1波数范围内出现多处吸收峰.在3 500～3 200 cm-1波数范围内出现一个较强烈并且宽的吸收峰,仙人掌果皮总黄酮吸收峰值为3 423 cm-1,芦丁标准品为3 429 cm-1,二者很接近,这是由于O-H基(缔合)的伸缩振动,说明了羟基的存在;芦丁标准品在波数为2 935 cm-1处的吸收峰和仙人掌果皮黄酮在波数为2 931 cm-1处的吸收峰为-CH2的反对称伸缩吸收[19]引起;C=O基的伸缩振动吸收区域主要为1 850～1 660 cm-1波数范围内,图8中芦丁标准品和仙人掌果皮黄酮吸收峰出现在1 850～1 500 cm-1较小范围内,这表明可能存在有酮类、醛类、酸类、酯类等化合物;在1 300～1 000 cm-1范围内有吸收峰揭示C-O的伸缩振动,可判断有C-O键的存在;芦丁标准品在781 cm-1处和仙人掌果皮黄酮在777 cm-1处的吸收峰是由苯环间位取代的面外变形振动引起[20].芦丁标准品和仙人掌果皮黄酮的红外光谱吸收有基本相似,初步判断仙人掌果皮总黄酮为黄酮醇.

3 结论与讨论

超声微波协同萃取仙人掌果皮黄酮的最佳提取工艺条件为:微波功率为200 W,超声波功率为480 W,料液比为1∶8(g·mL-1),乙醇浓度为60%,黄酮提取量为14.73 mg·g-1.仙人掌果皮黄酮提取物紫外-可见吸收光谱扫描在230～600 nm波长范围内进行扫描,出现的两个吸收峰带,与芦丁标准品特征吸收峰一致;红外光谱扫描在400～4 000 cm-1波数范围内进行扫描,可判断仙人掌果皮总黄酮应该是黄酮醇.

Faten M等[21]研究了埃及仙人掌果皮的乙醇提取物中含有的多酚、黄酮类活性成分,具有抗氧化和抗癌活性,本研究发现,三亚本地产仙人掌果皮的黄酮成分也具有良好应用基础,如海南日照强度大,皮肤易受阳光的紫外线辐射,研究发现 UVA 320～400 nm,对人体皮肤作用缓慢,但可致皮肤晒黑,所以又称“晒黑段”[22].仙人掌果皮黄酮在330～380 nm之间出现的峰I吸收峰,揭示如果将仙人掌果皮黄酮添加到防晒产品中,具有防止皮肤被紫外线晒黑的潜在功效.