生鲜乳中兽药残留的快速筛查与风险预警体系构建

田怀香，陈 彬，于海燕，周兴鑫，陈 臣

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

0 引 言

生鲜乳的质量控制是乳制品生产的重要前提。其中，生鲜乳的安全筛查是一个关键环节，关系着后续的乳制品生产、收购、加工、销售等多个阶段。近些年发生的一系列乳及乳制品安全事故警醒着公众[1]，生鲜乳中的兽药残留问题理应得到更多的关注。目前，生鲜乳中兽药残留主要包括抗菌类、抗寄生虫类、消炎镇痛类、农药除虫类、消化系统类和其他类六大类，“中华人民共和国农业部公告第235 号”[2]（以下简称为农业部235 号公告）中作出了明确的限量要求，但违规使用兽药的情况仍然非常严重。

随着生鲜乳兽药残留监测的种类与范围不断扩大，监测的方法也越来越方便和快捷[3]，从原来的免疫分析法[4-5]、微生物学分析法[6-7]逐步发展到了以具有高灵敏度的仪器分析方法为主的阶段，包括气相色谱[8-9]、液相色谱[10-11]、气相色谱质谱联用[12-13]和液相色谱质谱联用技术[14-15]，甚至一些结合高分辨功能组件的串联技术[16-18]。其中，高效液相色谱-串联飞行时间质谱法（High Performance Liquid Chromatography-high Resolution Time-of-flight Tandem Mass Spectrometry，HPLC-TOF-MS/MS）相比低分辨率的液相色谱-串联质谱法而言，不仅缩短了分析时间，还大大增加了可分析的化合物数目，适合大通量的兽药残留筛查。

此外，生鲜乳生产是一个动态的、连续的过程，每天的品质都有可能出现新的变化，而对即时数据的检测分析无法对将来或一段时间内的兽药残留发展趋势作出准确的预判，也不能对风险进行一定程序上的控制，因此属于一种“过时”的判定。因此，探索一种基于历史数据分析，在风险发生之前作出准确判断的安全预警方法是非常有必要的。常见的安全预警方法包括人工神经网络模型[19]、支持向量机模型[20]、休哈特控制图等。其中，休哈特控制图（Shewhart control charts）又称管理图，是由来自美国贝尔实验室的休哈特于1924 年正式发表的一种统计工具，也是进行“动态控制”工序的主要手段[21-22]。该理论由于其广泛的适用性，常应用于质量状况的动态控制。

本研究利用HPLC-TOF-MS/MS 方法对上海市牧场生鲜乳进行兽药残留筛查，基于筛查结果，探索并构建了一种安全预警方法，对生鲜乳中兽药残留情况进行识别、控制与评价，以便在风险发生之前作出准确判断。本研究针对生鲜乳中兽药残留难以预警和预警过时的问题提出解决方案，也为开展生鲜乳的品质监控提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）生鲜乳样品

本试验所用生鲜乳样品来自上海各牧场。

2）标准品

为了构建筛查谱库，共选择174 种兽药化合物标准品，包括β-内酰胺类、β-兴奋剂、阿维菌素类、苯并咪唑类、大环内酯类、非甾体类消炎药、磺胺类、抗球虫剂、喹诺酮类、类固醇类、林可酰胺类、氯霉素类、四环素类、糖皮质类、硝基咪唑类、镇静剂和其他类，共17 类（均购自美国Sigma Aldrich 公司）。

所有兽药化合物的标准品用甲醇或水配制成一定浓度的标准储备液，于-20 ℃储存。中间液用甲醇配制，质量浓度为10 µg/mL，于-20 ℃储存；在检测前配制成质量浓度为200 ng/mL 的混合标准工作液，于-20 ℃储存。

3）试剂

HPLC-TOF-MS/ MS 法所用到的有机溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷甲酸（美国Thermo 公司），氯化钠、无水硫酸钠（德国Merck 公司）均为HPLC 色谱纯。超纯水由Milli-Q 超纯水系统生产。

4）仪器与设备

Triple TOF TM 5600 质谱仪（美国 AB SCIEX 公司），配有电喷雾离子源；Waters 高效液相色谱仪（美国Waters公司），SORVALL ST 16R 离心机（美国Thermo 公司），旋转蒸发仪（中国IKA 公司），氮气浓缩仪（中国ANPEL公司），漩涡振荡器（中国Talbys 公司），Milli-Q 超纯水制造仪（美国Millipore 公司），超高压均质机（北京天恩瀚拓科技有限公司），涡旋分离器（上海达姆实业有限公司），超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 生鲜乳样品的选择

生鲜乳样品的抽样应该符合统计学原理，本研究采用系统抽样对上海市生鲜乳中兽药残留污染状况进行统计分析。将上海市50 个牧场的生鲜乳样品作为需要抽样的总体；将总体分成50 份（即各个牧场），采用简单随机抽样法从各个部分中抽取样品，将所得到的样品合并得到最终的筛查样本。具体为在5、6 月份对上海市50 个牧场的生鲜乳样品每周各抽取1 个生鲜乳样品，连续抽检6个星期，共计300 个筛查样本，以这些生鲜乳样品的兽药残留筛查结果为代表，反映上海市的生鲜乳在抽样时间段内兽药残留污染状况。具体试验流程安排见图1。

1.2.2 前处理方法

前处理方法参照文献[23]，具体步骤如下：①精确称取生鲜乳样品2.00 g 于50 mL 离心管中，混合振荡3 min后静置10 min；②加入1.0 g 氯化钠和1.0 g 无水硫酸钠，振荡1 min；③准确加入10 mL的乙腈，涡旋振荡处理5 min，于10 000 r/min 离心5 min，转移上清液至另一50 mL 离心管中；④再加入10 mL 的乙腈溶液重新提取一次，同样条件离心后上清液合并；⑤再加入10 mL 乙酸乙酯提取一次，同样离心条件离心后合并上清液，于50 ℃旋转蒸发至最小体积，用1 mL 甲醇复溶；⑥于-20℃冷冻除脂除杂2 h 以上，取出10 000 r/min 离心5 min，过0.22 µm 有机滤膜，供高效液相色谱-高分辨飞行时间串联质谱检测。

图1 生鲜乳中兽药残留筛查流程图 Fig.1 Flow chart of screening of veterinary drug residues in raw milk

1.2.3 高效液相色谱-高分辨飞行时间串联质谱检测

1）色谱条件

色谱柱为 Poroshell 120 EC-C18（3.0×150 mm，2.7 µm）；柱温为30 ℃；流动相A 为0.1 甲酸-水溶液，B 为甲醇；流速为350 µL/min；进样量：5 µL；线性梯度洗脱程序见表1。

表1 线性梯度洗脱程序 Table 1 Linear gradient elution program

2）质谱条件

离子源为电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）；扫描模式为正离子扫描（ESI+）；检测方式为全离子扫描；扫描范围为100～1 000m/z；电喷雾电压为5 500 V；气帘气流速为35 L/h；雾化气流量（GSl）和辅助气流量（GS2）均为55 L/h；离子源温度为600 ℃。去簇电压为80 V：碰撞能量为10 V；离子累积加速时间为0.25 s。在此质谱条件下，增加了信息相关扫描（Information Dependent Acquisition，IDA），进一步用于监测响应值超过1 000 的化合物，得到其子离子信息，扫描范围为 50 ～1 000 m/z，去簇电压（Declustering Potential，DP）为60 V；碰撞电压（Collision Energy，CE）为（35±15）V；离子累积加速时间为0.1 s。

一级全扫描获得的高质量精确质谱数据用于筛选及定性分析，IDA 全扫描获得的二级碎片离子信息用于进一步定性确证。

1.2.4 风险预警控制图分析方法

对比分析6 个批次共300 个生鲜乳样品中筛查出的兽药残留种类，发现泼尼松（Prednisone，Pre）的检出率较高，具有普遍代表性，因此选择生鲜乳中泼尼松构建休哈特控制图。因本研究未对上海市各牧场生鲜乳中兽药残留进行定量分析，且每个批次所收集筛查的生鲜乳样本数量一定，故采用泼尼松的检出数（Number of Prednisone Detected，Pn）控制图进行构建风险预警体系。

2 结果与分析

2.1 生鲜乳中多种兽药残留的快速筛查

2.1.1 筛查结果统计

试验检测方法采用前期研究建立并优化的方法[24]，图2 展示了300 个生鲜乳样品中筛查出的兽药种类和数量。由图2 可知，所有兽药残留共计42 种，涉及到的兽药种类共12 类。类固醇类兽药是所有生鲜乳兽药残留筛查中检出种类最多的兽药，共12 种；其次是糖皮质激素类，共6 种；镇静剂与喹诺酮类各5 种。6 批生鲜乳样品中，每批次都筛查出的兽药有6 种，包括噻苯哒唑（Thiabendazole，Thi）、烯丙孕素（Altrenogest，Alt）、倍氯米松（Beclomethasone，Bec）、咔唑心安（Carazolol，Car）、甲基睾酮（Methyltesterone，Met）、诺乙雄龙（Norethandrolon，Nor）。具体的兽药检出汇总情况见表2。

图2 上海市牧场生鲜乳样品兽药残留检出种类和数量分布 Fig.2 Type and quantity distribution of veterinary drug residues detected of raw milk samples from Shanghai pastures

表2 各批次上海市牧场生鲜乳样品兽药残留检出汇总 Table. 2 Summary of veterinary drug residues detected in raw milk samples from Shanghai pastures by batch

续表

2.1.2 污染分析

根据不同兽药的使用情况和对人体的危害，对7 大类兽药残留进行分析，并结合标准和农业部公告等，分析各类兽药监测的必要性。

1）类固醇类

类固醇类兽药是本次生鲜乳兽药残留筛查中检出种类最多的兽药，共12 种。类固醇类兽药主要用于调节奶牛体内雌性激素的平衡以及促进生长，同时对奶牛生殖疾患治疗也起着重要作用。就本研究检出的类固醇类兽药的危害而言，甲基睾酮在人体内的累积，可增加水肿、低血糖、肾脏毒性发生的概率；玉米赤霉醇药物及其代谢产物在人体中的残留会引起人体性激素机能紊乱和影响第二性征的正常发育，并且经过诱导还可能致癌。农业部235 号公告[2]中明确指出，甲基睾酮、玉米赤霉醇、己烷雌酚等都是禁止用于所有食品动物的兽药，且不得在生鲜乳中检出；另外，在NY/T 5030[25]《兽药使用准则》中明确规定禁止甲基睾酮作为促生长用兽药。

2）糖皮质类

其次是糖皮质类兽药，本次筛查共检出6 种。糖皮质类兽药主要用于奶牛体内或体外感染的炎症治疗，以及牛的酮病[26]的治疗。糖皮质类药物即使微量摄入，也会引起水、盐、糖、脂肪和蛋白质的代谢紊乱，并引起免疫和发育毒性等[27]。在本次筛查中，各个批次中检出率较高的泼尼松正是糖皮质类药物，泼尼松常被用于治疗奶牛体内或体外感染疾病，以及奶牛酮病等。泼尼松在人体内的短期累积会导致人血糖含量增高，此外，过量摄入泼尼松可引起抑郁或加重抑郁症状，甚至引起骨质疏松、青光眼、白内障等疾病，这为接下来预警体系的构建提供了依据。就本研究筛查出的6 种糖皮质类兽药而言，农业部235 号公告[2]中并没有做出清晰的使用和限量规定，但是在“中华人民共和国农业部公告第1031号”[28]中涉及到了牛奶中倍氯米松、氢化可的松与氟氢可的松的检测，证明了检测此类药物的必要性。

3）镇静剂

本次筛查共检出5 种镇静剂。镇静剂药物在总检出兽药中比例较大，此类药物具有抑制躁狂的作用，采样期间正是上海天气闷热的季节，奶牛因此会产生热应激，出现狂躁、不受控制的情况；同时加上产奶高强度需求，奶牛可能会因为挤奶器的挤压出现“闹脾气”的状况，此时便会使用注射用镇静药剂缓解应激反应。镇静剂对于人类的危害极大，在人体中的残留会引起过敏、心悸、体内各种器官病变等后果。本研究共检出5 种镇静剂药物，在总检出兽药中比例较大，这也符合当前天气使用镇静剂药物的规律；尽管农业部235 号公告[2]中对于被检出的5 种镇静剂没有做出清晰明确的规定，但此类药物的污染状况仍然值得关注。

4）喹诺酮类

本次筛查出5 种喹诺酮类药物，所占比例偏大。除了具有抗菌作用强、范围广的特点以外，喹诺酮类兽药还具有高效、低毒、价廉等特点[29-30]。然而，喹诺酮类药物在被摄入人体后，可导致胃肠疾病、头痛、头晕，诱发癫痫，影响软骨发育，长期累积会引起肝损害等副作用，造成不可逆的伤害。此次检出的5 种喹诺酮药物为环丙沙星、达氟沙星、氧氟沙星、萘啶酸、洛美星，农业部235 号公告[2]中规定环丙沙星和恩诺沙星总残留限量为100 µg/kg，达氟沙星残留限量为30 µg/kg。

5）磺胺类

本研究筛查出3 种磺胺类药物：甲氧苄啶、磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶。磺胺类药物结构类似对氨基苯甲酸，可以和细菌竞争二氢叶酸合成酶，影响细菌核蛋白的合成，从而达到杀死细菌的作用，因此，该类药物是现在最常用的抑菌类兽药[31]。磺胺类对人体最严重的伤害是随着量的累积引起人体肾功能衰退[32]。对于磺胺类药物的限量要求，农业部235 号公告[2]中规定其在牛/奶中限量不得超过100 µg/kg，这和国际食品法典会、欧盟以及一些欧美国家对磺胺类的限量一致。

6）β-兴奋剂

本研究共检测出3 种此类药物：沙美特罗、喷布特罗、沙丁胺醇。为了提高饲养动物的瘦肉率，使动物更加精壮[33]，不少饲养者也会将此类药物添加到饲料当中。然而，β-兴奋剂是一种明确被中国和欧盟禁止用于动物饲养过程中的兽药，但是常被违规作为生长促进剂使用；其次，人体摄入β-兴奋剂，会出现一系列毒副作用，如腹部剧烈疼痛、肌肉不受控制震颤、心跳和呼吸加促等[34]。在农业部235 号公告[2]中明文规定禁止沙丁胺醇用于所有动物源性食品，且不得在所有可食用组织中检出。沙丁胺醇相比其他类型兽药，在促生长、提高瘦肉率、降低脂肪等方面具有明显的优势，所以使用的频率较高，此类药物的残留状况需引起足够的重视。

7）其他类

除此之外，本研究还检出了其他类型的兽药：阿莫西林、莫能菌素、噻苯哒唑、吡利霉素、美托洛尔、盐霉素、罗硝唑。阿莫西林和莫能菌素都是一种抗菌类β-内酰胺药物，农业部235 号公告[2]中规定阿莫西林在牛奶中的最高残留限量为10 µg/kg，莫能菌素为50 µg/kg。噻苯哒唑是一种苯并咪唑药物，常用于驱肠虫、促消化。吡利霉素是一类林可酰胺药物，常用于抗菌。盐霉素属抗球虫剂，主要用于皮肤表面球虫感染疾病[35]，也被添加到饲料中促进生长。罗硝唑属硝基咪唑类，是一种高效抗原虫药物[36]。针对这几种兽药的残留，国内外相关标准和公告均没有做出明确的限量规定，但是其安全性仍需进一步通过长时间观察和监测进行确定。美托洛尔用于奶牛的情况并不常见，应属于其他类污染。

2.2 风险预警体系的构建

2.2.1 休哈特控制图的创建

根据本次试验的筛查情况，本研究采用泼尼松检出数（Number of prednisone detected，Pn）控制图进行构建风险预警体系。具体构建步骤如下：

1）数据统计

按照采样顺序，以每星期50 个生鲜乳样作为一个样本，统计6 个批次中泼尼松的检出个数，分别为2、5、1、2、4、3。

2）数据分析

计算6 个批次中心线值（Center Limit，CL）：CL==2.83；

计算6 个批次控制上限值（Upper Control Limit，UCL）

3）Pn 控制图分析

本研究以样品批次为横坐标，泼尼松检出数（Pn）为纵坐标，构建1～6 周上海市生鲜乳中泼尼松检出数的休哈特控制图，见图3。

图3 1～6 周生鲜乳中泼尼松检出数（Pn）控制图 Fig.3 Shewhart control chart of screening numbers of prednisone (Pn) of 6 weeks

由图3 可知，1～6 周的生鲜乳中泼尼松检出数（Pn）均未超出UCL 值（7.72），且在CL 线两端面分布均匀，未呈现不规律现象，说明1～6 周上海市牧场生鲜乳中的危险源——泼尼松残留呈现一个相对稳定的状态，不需要触发风险预警。

2.2.2 生鲜乳中兽药残留风险预警预测

试验对第7 周上海市生鲜乳中泼尼松检出个数进行预测，分别假设检出数为6 和10 个。

1）假设1：第7 周生鲜乳中泼尼松检出数为6 个（Pn=6），重新进行休哈特控制图的计算以确定控制中值与控制上限，分析如下。

根据假设1，7 个批次中泼尼松的检出个数分别为2、5、1、2、4、3、6。

计算7 个批次控制上限UCL 值：UCL=8.55；

以样本批次为横坐标，泼尼松检出数Pn 为纵坐标，构建1～7 周上海市生鲜乳中泼尼松检出数的休哈特控制图，见图4。

由图4 可知，1～7 周的生鲜乳中泼尼松的检出个数都没有超出控制上限（8.55），说明此期间该兽药化合物的检出呈现一个稳定的状态，不需要触发风险预警。

2）假设2：第7 周生鲜乳中泼尼松检出数为10 个（Pn=10），重新进行休哈特控制图的计算以确定控制中值与控制上限，分析如下：

根据假设2，7 个批次中泼尼松的检出个数分别为2、5、1、2、4、3、10。

图4 假设1 泼尼松检出数（Pn）控制图 Fig.4 Shewhart control chart of screening numbers of prednisone (Pn) under hypothesis 1

7 个批次控制上限UCL 值：UCL=9.52；

以样本批次为横坐标，泼尼松检出数Pn 为纵坐标，构建1～7 周上海市生鲜乳中泼尼松检出数的休哈特控制图，见图5。

图5 假设2 泼尼松检出数（Pn）控制图 Fig.5 Shewhart control chart of screening numbers of prednisone (Pn) under hypothesis 2

由图 5 可知，第 7 周生鲜乳中泼尼松检出数Pn=10＞UCL=9.52，说明这个周的阳性检出数已经与前6个星期的历史数据有了显著性的差异，超出了控制图的控制范围，表现出了异常，使控制图失去了控制平衡。此现象可能导致风险的进一步发生甚至风险的进一步扩大，所以触发了风险预警。此时需要判断此次风险的发生是偶然原因造成的还是系统产生的，对生鲜乳样品的生产流程进行追踪，追溯其兽药使用用量、使用时间、使用过程，并通过人、物、环境三大因素，分析问题存在的原因，找出解决问题的方法，防止风险的增长甚至从根本上防止风险的再次发生。

3 结 论

利用高效液相色谱-高分辨飞行时间串联质谱（HPLC-TOF-MS/MS）方法共从300 个生鲜乳样品中筛查出42 种兽药残留，涉及类固醇类（12 种）、糖皮质类（6 种）和镇静剂（5 种）等12 大类。以生鲜乳中泼尼松残留检出数为例，利用休哈特控制图构建风险预警体系。在筛查的6 个星期中，泼尼松的检出数未超过对应的控制上限值7.72，泼尼松检出数控制图呈现稳定的状态；第7 周的预警状态，则会根据该周的检出数不同发生变化：当泼尼松的检出数为6 时，不触发风险预警；当泼尼松的检出数为10 时，触发风险预警。利用HPLC-TOF-MS/ MS 可以对生鲜乳样品进行高通量的兽药残留筛查，休哈特控制图结合历史数据可以对生鲜乳样品的兽药残留进行有效的风险监测和预警。