MBL基因单核苷酸多态性分布与类风湿性关节炎易感性相关性的研究

侯玲 王玉娜 周永忠

摘 要

[目的]分析MBL基因启动子区-221G/C、-550G/C SNP位点在宁夏地区的分布特征，并探讨其与类风湿性关节炎（RA）发病的相关性。[方法]采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶链式反应-序列特异性引物（PCR-SSP）技术，对400名宁夏健康个体及380名RA患者MBL-221G/C、MBL-550G/C进行基因分型。[结果]（1）RA患者中：MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型频率和等位基因频率分布在不同年龄、不同性别组间的比较中均不存在统计学差异（P>0.05）。（2）在RA患者与健康对照组间的比较中，MBL-550G/C基因型频率和等位基因频率分布均存在统计学差异（P<0.05）。[结论]（1）RA的发病在MBL-221和MBL-550多态位点不受年龄、性别、的影响。（2）MBL-550位的C等位基因可能是宁夏地区RA发生的危险因子。

关键词

宁夏;甘露糖结合凝集素;单核苷酸多态性;类风湿性关节炎

中图分类号： R593.22                       文献标识码： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.057

Abstract

[Objective] To determine the distribution of Mannose-Binding Lectin（MBL）gene polymorphism in  Ningxia，To study on the influence of MBL genepolymorphism in RA. [Methods]By using PCR-RFLP and SSP-PCR， we determined MBL genotype and haplotype of MBL-221G/C、MBL-550G/C in 400 healthy people which from Ningxia district， 380 RA patients of Ningxia district. [Results]（1）At MBL-221G/C and MBL-550G/C， There were no statistically significant differences of nation、sex and age in either the frequency of genotypeor that of allele in MBL genepolymorphism of RA patients（P>0.05）. （2）At MBL-550G/C， there were statistically significant differences in MBL genepolymorphism genetictype frequencies between RA patients and healthy（P<0.05）.[Conclusion]（1）The onset of RA is not affected by age ，gender and ethnicity. （2）At MBL-550G/C， C allele probably is one of the risk factors which may lead to RA disease in Ningxia district.

Key words

Ningxia;MBL;SNP;RA

1975年，人們发现哺乳动物细胞内可能存在一种能与甘露糖特异结合的蛋白质，1978年，Kawasaki T等[1]的研究证实这种蛋白质的存在，随后将此蛋白质命名为甘露糖结合凝集素（MBL），并建立了MBL的cDNA克隆。人MBL基因全长7kb，位于第10号染色体长臂10q11.2-q21。种族、民族、年龄、应激状态、基因变异及多态性等多种因素都会影响MBL血清水平[2]。其中结构基因外显子Ⅰ密码子点突变和启动子区SNP的调控对MBL血清浓度影响最大[3]。由于启动子区呈现出单核苷酸多态性（SNP），对MBL基因的转录进行调控，从而使不同种族之间、甚至同一种族不同个体间的MBL血清水平差异显著[4]。

类风湿性关节炎（RA）是一种病因不明的、以关节疼痛、肿胀、畸形为主要临床特征的慢性全身性疾病，是遗传因素与环境因素共同作用的多基因疾病。许多研究表明，MBL基因可能是影响RA疾病发病的候选基因[5-8]。本课题组在研究MBL基因外显子Ⅰ密码子点突变与宁夏地区RA相关性的基础上，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分型法（PCR-RFLP）和聚合酶链式反应-序列特异性引物（PCR-SSP）技术检测MBL基因启动子区SNP位点多态性在宁夏地区的分布特征，并探明其与RA的发病是否存在相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源及处理

基因组DNA样本来源于宁夏不同地区。健康对照400例，来源于宁夏不同地区体检健康人群，年龄在7岁-73岁之间，其中男性210例、女性190例。RA患者380例，样本来源于住院患者，RA的诊断以美国风湿病学会（ARA）1987年修订的RA分类标准为依据，年龄在7岁-77岁之间，其中男性190例、女性190例。以上研究个体均无血缘关系，追溯3代均为同一民族个体，且在宁夏地区居住3代以上。根据知情同意原则，常规抽取所选个体的外周静脉血2ml，加入0.2mlACD抗凝剂，充分混匀，进行DNA提取，之后加入100μl的DNA水化液完全溶解DNA，-20℃保存备用。

1.1.2 试剂与仪器

DNA提取试剂盒（北京天根公司），电泳级琼脂糖（上海生工生物工程技术服务有限公司），PCR引物由上海英骏生物有限公司合成，限制性内切酶MspI购自大连宝生生物公司。PCR反应试剂包括：5×PCR反应液、2.5Mm dNTP及LA Taq DNA聚合酶（5U/μl）。丙烯酰胺溶液（Acr：Bis=29：1），分子大小标准物：MarkerⅠ、2000bp DNA Marker。硝酸银染色试剂。琼脂糖凝胶电泳试剂包括1×TAE电泳缓冲液、电泳上样缓冲液、0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）。

台式高速离心机（Eppendrof，Germany），MycycleTM Thermal Cycler型PCR仪（BIORAD公司）。DYY-8B型稳压电泳仪，DYY-32A型水平电泳槽，DYCZ-24A型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）。凝胶电泳图像分析系统（Bio-Rad，U.S.A）。

1.2 方法

1.2.1 RFLP-PCR法检测MBL-221G/C、SSP-PCR法检测MBL-550G/C

根据全基因组PCR的引物设计原则，利用Primer Primer5.0软件，自行设计PCR引物，MBL-221引物序列为：F： 5' –CGGTCCCATTTGTTCTCACTGCCCC-3'，R： 5'- TGTGACACTGCGTGACTA-3'。MBL-550引物序列为：-550c： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT C-3，-550g： 5-TGC TTA CCC AGG CAA GCC TGT G-3，-550：  5-CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3。

PCR总反应体系为15μl， PCR反应条件：94°C预变性4分钟后进入循环，每个循环为：94℃变性30秒，63℃（MBL-221位点）、60℃（MBL-550位点）退火30秒、72℃延伸1.5分钟，共循环30个周期，最后在72°C延伸10分钟。MBL-221位点PCR产物为152bp，MBL-550位点PCR扩增产物为884bp。

扩增反应结束后，取PCR產物3μl与0.5μl电泳上样缓冲液混匀，依次上样于2%的琼脂糖凝胶中，以2000bp DNA Marker做参照，电泳30分钟后，将琼脂糖凝胶用0.5μg/ml的溴化乙锭染色15-20分钟，然后用蒸馏水漂洗2次，紫外灯下判读PCR扩增情况和MBL-550位基因型。样本DNA的PCR扩增产物在 Marker两侧有两个泳道，若Marker左侧泳道未出现DNA条带而右侧出现DNA条带则为野生纯合子GG，若Marker左侧泳道出现DNA条带而右侧未出现DNA条带则为突变纯合子CC，若Marker左侧泳道出现DNA条带同时右侧也出现DNA条带则为杂合子GC。

然后将MBL-221位点PCR扩增产物进行MspI内切酶酶切，总反应体系为10μl， 37℃水浴酶切1～2h。酶切产物经8%非变性凝胶电泳和硝酸银染色，用凝胶电泳图像分析系统分析结果并记录其基因型，野生纯合子GG（127bp，25bp），突变纯合子CC（152bp），杂合子GC（152bp，127bp，25bp）。

1.2.2 统计学方法

研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度用？字2检验;MBL基因型频率与等位基因频率采用频率计数法，组间基因型频率及等位基因频率比较采用？字2检验。均应用SPSS统计软件进行统计，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MBL-221 RFLP-PCR结果、MBL-550 SSP-PCR结果

在宁夏地区健康对照和RA患者中，均检出MBL-221和MBL-550位点具有单核苷酸多态变异。

2.2 宁夏地区MBL基因单核苷酸多态性分布特征及其与RA相关性

对健康对照的？字2检验结果显示，本研究人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），具有群体代表性。在分析健康对照和RA患者MBL-221、MBL-550位点多态性时，进行了性别和年龄分组，年龄段分组依据联合国世界卫生组织提出的年龄分段标准，44岁以下为青年人，45岁以上为中老年人。

2.2.1 宁夏RA患者MBL-221、MBL-550位点多态性

MBL-221G/C、MBL-550G/C的基因型频率和等位基因频率分布在不同年龄、不同性别组间的比较中均不存在统计学差异（P>0.05）（表1，表2）。

2.2.2 宁夏健康对照和RA患者MBL基因频率和等位基因频率的比较

在RA患者与健康对照组间的比较中，MBL-221G/C的基因型频率和等位基因频率在两组间的比较中均无统计学差异（P<0.05）（表3）。MBL-550G/C基因型频率在两组间存在统计学差异（P<0.05），MBL-550位点C等位基因频率在RA中的分布高于对照组，其差异性具有统计学意义（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）（表4）。

3 讨论

我国类风湿性关节炎（RA）患病率约为0.3%，患者人数超过了500万，本病是造成我国人群丧失劳动力，甚至致残的主要病因之一，严重影响人们的生活质量并加重家庭经济负担。血清MBP作为一种急性反应蛋白会受RA疾病本身的影响，而研究MBL基因单核苷酸多态性与RA相关性的优势在于MBL多态性不受RA病程的影响。因此，探讨MBL基因作为影响RA疾病发病候选基因的可能性并对其进行群体遗传结构分析，在筛选RA易感人群，并采取有效的预防和治疗措施等方面都具有潜在的应用前景。RA是遗传因素与环境因素共同作用的多基因疾病，关于MBL基因单核苷酸多态性与RA的可能联系研究较多，许多研究结果表明MBL和RA的发生和发展可能存在相关性[5-8]。本课题组采用PCR-SSP和PCR-RFLP检测技术研究了MBL基因启动子区MBL-221G/C、MBL-550G/C两个SNP位点多态性分布特征及其与宁夏地区RA发病的相关性。在RA患者与健康对照组间的比较中，MBL-221G/C的基因型频率和等位基因频率在两组间的比较中均无统计学差异（P>0.05）。因此，在宁夏地区，MBL-221位单核苷酸多态性可能与RA的发病不具有相关性。Ip[9]等对中国南方RA病人与健康对照的MBL表型、基因型及启动子多态性进行研究发现，启动子区第550位多态性在两组间差异显著，RA病人血清中MBL水平显著低于健康对照。本研究结果显示，MBL-550G/C基因型频率和等位基因频率在两组间存在统计学差异（P<0.05），RA患者变异纯合基因型CC频率显著高于健康对照（P=0.009），MBL-550位变异型C等位基因频率在RA中的分布高于对照组，其差异性具有统计学意义（P=0.047，OR=1.26，95%CI：1.00～1.59）。此研究结果提示，MBL-550位单核苷酸多态性可能与宁夏地区RA的发病具有相关性，MBL-550位变异型C等位基因可能是宁夏地区RA发病的候选基因。比较中国南方和北方宁夏地区MBL-550位点的多态性变异和与RA疾病的相关性，结果是一致的。

对RA患者的研究结果显示，MBL-221G/C、MBL-550G/C两个位点的基因型频率和等位基因频率分布在不同民族、不同年龄、不同性别组间的比较中均不存在统计学差异（P>0.05）。

综上所述，本研究结果提示：RA的发病在MBL-221和MBL-550多态位点不受年龄、性别和民族因素的影响。MBL-221位点的多态性变异可能与宁夏地区RA发生不相关，而MBL-550位点的多态性与宁夏RA发病关系更为密切，其变异等位基C可能是宁夏地区RA发生的危险因子。RA是一种复杂的由多种遗传因素和环境因素共同作用的自身免疫性疾病，MBL作为机体天然免疫的第一道防线，其生物学功能的重要性已被充分肯定，个体MBL基因变异，MBL血清水平低下或功能缺损，从而导致补体凝集素途径的活化不足，在明确MBL缺损后，用外源性MBL治疗已显示出临床应用價值。本研究结果可为针对性地治疗RA提供依据，并提示在临床工作中基于不同的基因型采取相应的干预措施。而有关MBL途径活化补体系统和免疫调控的机制、MBL与细胞受体识别并结合的机制和调节作用等问题，本课题组会在前期工作的基础上做进一步的深入研究，以期可以对于RA的早期诊断、预防和治疗提供思路。

参考文献

[1]Doroti Pirulli，Michele Bonitto，Laura Vatta，et al.Polymorphisms in the promoter region and at codon 54 of the MBL2 gene are not associated with IgA nephropathy.[J].Nephrol Dial Transplant.2001，16：759-764.

[2]王艾丽等.甘露聚糖结合凝集素的生物学功能及其临床意义.医学研究生学报，2002，5：458-462.

[3]Presan is J，S KojimaM， Sim1 RB. Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin（MBL）[J].Biochem Soc Trans，2003，31（4）：748-752.

[4]Koch A，Melbye M，Sorensen P，et al.Acute respiratory tract infection and mannose binding lectin insufficiency during early chindhood.[J ]Am Med Assoc，2001，285：1316-1321.

[5]Damon P. Eisen， Robyn M. Minchinton. Impact of Mannose-Binding Lectin on Susceptibility to Infectious Diseases. Clinical Infectious Diseases 2003， 37：1496–1505.

[4]Guo YL， Liu Y， Ban WJ， Sun Q， Shi GL.Association of mannose-binding lectin gene polymorphisms with the development of pulmonary tuberculosis in China.[J]BWC infectious Disrases，2017，17：210.

[5]Orsatti CL， Nahás EAP， Nahas-Netoa J， Orsatti FL， Linhares IM， Witkin SS， et al. Mannose-binding lectin gene polymorphism and risk factors for cardiovascular disease in postmenopausal women.？Mol Immunol.2014;61：23–27. doi： 10.1016/j.molimm.2014.05.003.

[6]Nisihara R，Skare T， et al.Mannose binding lectin deficiency and susceptibility to infections in patients with？rheumatoid arthritis.Rheumatology （Oxford）.2016 May;55（5）：951-2.

[7]Epp Boschmann S， Goeldner I， Tuon FF， et al.Mannose-binding lectin polymorphisms and？rheumatoid arthritis： A short review and meta-analysis.Mol Immunol.2016 Jan;69：77-85.

[8]Martiny FL，Veit TD，Brenol CV，et al.Mannose-binding lectin gene polymorphisms in Brazilian patients with rheumatoid arthritis.J Rheumatol. 2012 Jan;39（1）：6-9.

[9]Ip WK，Lau YL，Chan SY，et al.Mannose binding lectin and rheumatoid arthritis in southern Chinese.Arthritis Rheum，2000，43：1679-1687.

[10]Robin A. Liang，Ina I. H？iland.Plasma levels of mannose‐binding lectin and future risk of venous thromboembolism. J Thromb Haemost. 2019;17：1661-1669.