亚慢性烟雾暴露对大鼠肺脏蛋白组学的影响

尹晶晶，苏加坤，李梅，徐达，秦秀军，蔡继宝

1 中国辐射防护研究院，药物毒理与放射损伤药物山西省重点实验室，中核放射毒理与放射性药物临床前评价重点实验室，山西太原学府街102号 030006；2 江西中烟工业有限责任公司，江西南昌京东大道201号 330096

大量的流行病学调查结果显示，吸烟有害健康。吸烟与人体多种呼吸道及心肺疾病具有相关性，如气管炎、慢性阻塞性肺病、肺气肿、冠心病及心肌梗塞等。因此，吸烟对人体健康的影响一直受到人们的关注[1-3]。吸烟对呼吸系统的损伤是一个长期的过程，因此，需要关注烟气慢性暴露对呼吸系统损伤的机理研究。

随着分子生物学的发展，高效液相色谱、质谱的技术在生物学领域得到广泛应用。蛋白组学研究成为近年来的研究热点，通过检测蛋白的表达水平，建立蛋白相互作用网络，实现了在蛋白水平对作用机制的深入研究[4]。蛋白质组学也是疾病诊断和治疗的有效方法之一。应用蛋白质组学技术开展烟雾暴露损伤效应研究的成果不断发表。Ma等利用蛋白组学技术研究了大鼠烟气暴露4周后肺脏蛋白表达变化情况[5]。Phillips等利用蛋白组学技术证明了雌性小鼠停止暴露于烟气中后肺部炎症减少[6]。本实验应用串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）标记蛋白组学技术研究烟雾全身暴露90天对雄性大鼠肺脏损伤的影响，从分子机制方面探讨长期吸烟或长期暴露于烟气中对肺脏的损伤，为烟草减害机理研究提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

普通卷烟，烟气烟碱量1.0 mg/支，烟气焦油量10.0 mg/支，一氧化碳10.0 mg/支，由江西中烟工业有限责任公司提供。

1.2 仪器和试剂

HRH-WBE3986型动物全身动态暴露系统（北京慧荣和科技有限公司）；酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gelelectrophoresis, PAGE）电泳仪（北京市六一仪器厂）；ImageScanner扫描仪（美国GE Healthcare公司）；Q Exactive plus质谱仪（美国ThermoFisher公司）；Easy-nLC 1200液相色谱仪（美国ThermoFisher公司）。

SDS裂解液（上海碧云天公司）；PMSF（美国Amresco公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国ThermoScientific公司）；tandem mass tag（TMT）标记试剂盒（美国ThermoFisher公司）；质谱级乙腈（美国ThermoScientific公司）；羟胺（美国Sigma公司）；水（美国ThermoScientific公司）。

1.3 动物

SPF级雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠，9～10周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK-（京）2016-0006，质量合格证号：11400700300671。动物饲养于中国辐射防护研究院药物安全性评价中心动物实验设施内，使用许可证号：SYXK（晋）2013-0002。

1.4 烟雾暴露染毒

雄性SD大鼠96只按体质量随机分为对照组（空白对照组，不暴露于烟气中）和染毒组，染毒组动物放置于动物全身动态暴露系统染毒腔体内，腔内O2浓度为19%～21 %，CO2浓度小于0.5%，烟雾浓度（1100±110）% mg/m3，暴露时间60 min，每天染毒1次，连续染毒90天。染毒90天后存活率100%，健康状况良好，对照组和染毒组各取3只大鼠肺脏进行蛋白组学检测。

1.5 蛋白组学检测及分析

1.5.1 蛋白提取

烟雾暴露90天后，取对照组和染毒组大鼠肺脏组织加入裂解液提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳法检测提取蛋白的质量。

1.5.2 TMT标记及蛋白组学检测

提取出的总蛋白用胰蛋白酶酶解后，用TMT试剂盒进行标记，经反相色谱分离，真空冷冻干燥后，进行液相色谱-质谱联用分析。

1.5.3 数据处理

应用Proteome DiscovererTM 2.2（美国Thermo公司）软件进行蛋白质鉴定。使用数据库为UniProt大鼠数据库。以差异倍数FC > 1.2，且差异显著性P-value < 0.05为标准筛选差异表达蛋白。

1.5.4 生物信息学分析

通过OmicsBean分析平台对筛选出的差异表达蛋白进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能注释分析、KEGG信号通路分析及蛋白互作网络分析。

2 结果

2.1 烟雾暴露诱导的大鼠肺脏差异蛋白鉴定结果

雄性SD大鼠经全身暴露烟雾染毒90天，取肺脏组织提取蛋白质，经胰蛋白酶消化和TMT标记，利用液质联用技术进行分析，分析后进行数据库检索，筛选出可信蛋白3452个。

以差异倍数大于1.2倍，P<0.05为差异显著性标准，染毒组与对照组相比筛选出差异表达蛋白133个，其中99个蛋白上调表达，34个蛋白下调表达。

2.2 差异表达蛋白GO富集分析

通过GO富集分析对筛选出的133个差异表达蛋白进行生物过程（Biological Process）、细胞成分（Cellular Component） 和 分子功能（Molecular Function）三方面的分析，研究差异表达蛋白在功能上的分布。通过GO分析结果显示133个差异表达蛋白富集于2283种生物过程，364种细胞成分和489类分子功能，其中差异显著（P<0.05）的生物过程602种，细胞成分131种，分子功能158类。

图1显示了生物过程、细胞成分和分子功能三类富集分析差异显著性前十的条目。生物过程分析表明，差异表达蛋白主要涉及氧化还原过程、肌肉系统过程、肌肉结构发育、肌肉器官发育、横纹肌组织发育、肌肉收缩、肌肉组织发育、横纹肌收缩、心室心肌组织发育及肌肉细胞发育（表1）。

图1 染毒组大鼠肺脏组织差异蛋白GO富集分析结果Fig.1 Enrichment analysis results of GO in lung tissues of rats in treatment group

细胞成分分析表明，差异表达蛋白主要涉及细胞质、细胞器、肌节、线粒体、收缩纤维、肌原纤维、胞外区、线粒体内膜蛋白复合物、收缩纤维及线粒体呼吸链（表2）。分子功能分析表明，差异表达蛋白主要涉及肌动蛋白丝结合、肌动蛋白结合、氧化还原酶活性、长链脂肪酸转运活性、蛋白复合物结合、肌肉大分子组分、肌肉结构成分、细胞骨架蛋白结合、脂肪酸转运活性及肌钙蛋白C结合（表3）。

表1 差异表达蛋白的主要生物过程分析Tab.1 Biological process analysis of differentially expressed proteins

表2 差异表达蛋白的主要细胞成分分析Tab.2 Cellular component analysis of differentially expressed proteins

表3 差异表达蛋白的主要分子功能分析Tab.3 Molecular function analysis of differentially expressed proteins

2.3 差异表达蛋白KEGG富集分析

KEGG通路分析结果显示，本研究筛选出的133个差异表达蛋白涉及87条信号转导通路，其中差异显著（P<0.05）的通路有21条。差异显著性排前10位的通路，主要包括心肌收缩、氧化磷酸化、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、非酒精性脂肪肝病、代谢途径、肥厚性心肌病、扩张性心肌病及心肌细胞中的肾上腺素信号通路（表4）。

2.4 差异表达蛋白相互作用分析

将筛选出的差异表达蛋白及KEGG通路之间进行蛋白互作分析，图2显示为KEGG显著性前十的通路及与之互作的蛋白之间的互作网络图。

图2 染毒组大鼠肺脏组织差异蛋白互作分析结果Fig.2 Interaction analysis results of differentially expressed proteins in lung tissues of rats in treatment group

表4 差异表达蛋白的通路分析Tab.4 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins

3 讨论

吸烟对人体健康的危害不言而喻。烟草烟雾中含有多种有害物质，如尼古丁、多环芳烃、一氧化碳、氮氧化合物及醛类等，其中多种为致癌物，容易诱发人体癌症、呼吸系统、心血管、免疫等多种疾病。人体呼吸道系统对烟雾暴露最为直接和敏感，烟草烟雾中含有的有害成分可通过肺脏进入循环系统，进而影响更多的组织器官。近年来蛋白质组学在疾病的早期诊断、靶点和生物标志物筛选方面发挥巨大作用。本实验采用蛋白组学技术研究雄性SD大鼠全身暴露于烟雾中染毒90天肺脏组织蛋白表达的变化情况，选出差异表达1.2倍以上的蛋白133个。

烟雾暴露90天，通过对差异表达蛋白进行GO富集分析，发现差异表达的蛋白主要参与602种生物学过程、131种细胞成分及158类分子功能。有文献报道利用定量蛋白组学在肺成纤维细胞中发现差异表达的蛋白参与了应激反应、线粒体活动和衰老过程[7]。细胞成分分析显示烟雾暴露90天后，差异蛋白在线粒体中显著富集，并且富集的生物学过程中差异最显著的是氧化还原过程。有29种差异蛋白参与了氧化还原过程，包括顺乌头酸酶2（ACO2）、烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）、酰基辅酶A脱氢酶（ACADL）等。ACO2是细胞中重要的铁硫蛋白酶，定位于线粒体中，是三羧酸循环中一种重要的酶，具有很强的催化活性，能催化柠檬酸氧化形成异柠檬酸。ACO2活性不仅反映线粒体氧化磷酸化水平，还反映了线粒体中活性氧的水平[8]。NNT是一种参与NADPH形成的线粒体酶，可调控线粒体内超氧化物的清除，以及调控三磷酸腺苷合成功能的维持[9,10]。ACADL在线粒体中特异性分解酰基辅酶A，是脂肪酸氧化的关键酶[11]。这三种蛋白主要分布在线粒体中，而线粒体是机体内产生能量的细胞器。是细胞进行有氧呼吸的主要场所，还参与了细胞凋亡和细胞周期的调控。与细胞成分分析结果蛋白定位富集于线粒体是一致的。利用本实验筛选得到的结果提示肺脏组织的线粒体功能研究将是长期吸烟致肺损伤的机制研究的一个方向。

吸烟能通过破坏骨骼肌代谢，增加炎症和氧化应激反应，并激活多种细胞内信号通路，引起肌肉损伤[12,13]。Elamin等在C57BL/6小鼠中发现烟雾暴露对肺部激动蛋白骨架有影响[14]。本研究中，GO富集分析发现差异蛋白主要富集在肌肉组织，研究结果提示亚慢性烟雾暴露可能对雄性大鼠肺脏肌肉组织有影响。

吸烟可通过增加冠状血管收缩，减少冠状动脉血流量，增加心肌需氧量，增加氧自由基的产生和增强血栓形成，加剧心肌缺血。有研究报道二手烟暴露3周后，幼鼠心肌梗死面积增加，吸烟增加了心脏病死亡风险[15]。长期吸烟可引起慢性阻塞性肺病，患慢性阻塞性肺病肺部临床症状表现为肺部炎症，还发现肌肉萎缩和功能障碍等临床症状，并且慢性阻塞性肺病进一步发展可导致肺原性心脏病[16]。本研究中，KEGG通路分析显示心肌收缩、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、及心肌细胞中的肾上腺素信号通路等发生差异表达，提示亚慢性烟雾暴露可诱导心肺疾病的发生。

4 结论

本研究以雄性SD大鼠肺脏组织为实验材料，研究了全身暴露90天后肺部组织的蛋白组学变化，发现烟雾暴露90天后，对肺部组织的氧化还原过程和肌肉组织有影响，调控心肺疾病的信号通路。这些结果为初步探讨长期吸烟或长期暴露于烟气中对肺部损伤的分子作用机制提供依据，为烟草减害机理研究提供实验数据。