钙离子ATP酶2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗大鼠慢性心力衰竭

王晓露

（山西医科大学晋祠学院，山西太原030025）

心力衰竭是各类型心脏疾病进展至终末期的常见疾病类型，据不完全统计，每年因心力衰竭死亡患者有40万，其死亡率占同期心血管疾病的40%[1]。该病具有较高的致残率、致死率，明显增加了社会经济负担及卫生资源，成为全球关注的重点问题。近年来，药物对心力衰竭的治疗取得一定进展，但其疗效欠佳，预后较差[2]。而心脏移植手术供体缺乏、排斥反应明显，心肌成形术难以耐受，故需探索一种新的治疗方法。基因疗法、细胞移植是近年来医学领域新的治疗策略，但基因疗法需明确致病靶基因，降低基因表达扩散以及细胞移植的保护，提高其存活率等问题仍需进一步处理[3]。因此有研究[4]将基因疗法与细胞移植相结合，以此修正两种疗法的缺陷，充分发挥治疗作用。本研究拟建立慢性心力衰竭大鼠模型，分析钙离子ATP酶2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗作用，旨在为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取由北京医科大学动物实验中心提供的雄性SD大鼠及雌性SD大鼠，4周龄，清洁级。将雄性大鼠作为骨髓供体，36只雌性大鼠为细胞移植受体及基因治疗的受体，体重200～250g；正常饮食、饮水。

1.2 试剂与仪器

浙江医科大学医疗仪器厂生产的小动物呼吸机，德国Leica公司生产的冰冻切片机，Philips公司生产的心脏超声心动图。胎牛血清、IMDM培养基、胰蛋白酶由Sigma公司提供，氯胺酮由上海第一生化药业公司提供，蛋白酶K由北京精益化工产品公司提供。

1.3 实验方法

模型建立：将36只雌性大鼠进行慢性心力衰竭大鼠模型建立，左冠状动脉结扎，制作模型，造模成功后将其分为4组：对照组（n=9），腺病毒空载体；A组（n=9），钙离子ATP酶2a基因治疗；B组（n=9），骨髓干细胞移植治疗；C组（n=9），经基因修饰后的骨髓干细胞移植治疗。另选取雄性大鼠作为骨髓供体。

骨髓干细胞：雄性大鼠乙醚麻醉后，处死。取下肢长骨，骨腔冲洗，离心10 min，转速15 000 r/min，留取中间层液体，添加磷酸盐缓冲液，离心3次，转速1 500 r/min，丢弃淋巴细胞分离液。将细胞添加培养瓶（含有20%胎牛血清、青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L）内，37 ℃，置入培养箱内培养。每3 d更换一次液，显微镜下观察细胞生长。当其将近铺满瓶底，进行传代至第3代，取出非贴壁的球形骨髓造血细胞，获取纯化骨髓干细胞。

骨髓干细胞生长至90%并汇合，培养液吸取，置入钙离子ATP酶2a病毒工作液、无血清的IMDM培养基，将其孵化12 h，病毒液吸取后继续培养。转染第2 d，显微镜下观察细胞有绿色荧光表达，收取细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，待细胞变圆以完全培养基停止消化，离心10 min，转速1 000 r/min，丢弃上清液，观察计数。B、C组移植5×106个细胞。

1.4 观察指标

（1）大鼠模型建立后，于治疗前、治疗后采用超声心动图评价其心脏功能，包括左室前壁、室间隔收缩与舒张期纵向峰值速度、左室射血分数（LVEF）；（2）统计骨髓干细胞阳性率，即利用染料Hoechest标记，选取10个视野内阳性细胞比例；（3）统计肌浆网钙离子ATP酶2a基因及蛋白表达，提取心肌组织内的DNA、RNA，以PCR鉴定；取心肌组织2g，以组织裂解液裂解，反复冻融，离心，采集上清蛋白质样本，并测定其含量。

1.5 统计学方法

SPSS20.0统计学软件处理数据。计量资料用（±s）表示，采取重复方差F检验；计数资料用百分比率（%）表示，采取χ2检验；P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 慢性心力衰竭模型建立

大鼠行左冠状动脉结扎4周后，超声心动图测定左室射血分数≤45%，左室短轴切面呈不规则扭动或不规则摆动，各切面左室前壁、侧壁菲薄，向外膨出，室壁节段性运动异常，对侧室壁运动加强。长轴切面显示左室轮廓扩大呈球形，即为慢性心力衰竭建立成功。

2.2 骨髓干细胞移植存活率

治疗21 d，经连续切片绿色荧光染色检测，C组骨髓干细胞移植存活率98%，B组骨髓干细胞移植存活率72%，差异有统计学意义（P≤0.05）。

2.3 心脏功能

如表1所示，治疗后21 d，A、B、C组的LVEF明显高于对照组，左室前壁、室间隔收缩与舒张期纵向峰值速度高于对照组，其中C组较A、B组升高明显，差异有统计学意义（P≤0.05）。

表1 比较四组LVEF及左室前壁、室间隔收缩与舒张期纵向峰值速度

2.4 肌浆网钙离子ATP酶2a基因及蛋白表达

如表2所示，治疗后21 d，A、C组肌浆网钙离子ATP酶2a基因及蛋白表达明显高于B组、对照组，其中C组表达提高明显，差异有统计学意义（P≤ 0.05）。

表2 肌浆网钙离子ATP酶2a蛋白表达（U/mg）

3 讨论

近年来，我国心力衰竭发生率及带来的经济负担呈逐年增加趋势，成为世界卫生组织重点关注的疾病。随着现代医疗技术的发展，对心力衰竭致病机制的研究日渐深入，并提出基因疗法、细胞移植疗法，以期保护心肌组织，挽救濒临死亡的心肌组织，增强心肌功能[5]。现今，基因疗法集中在细胞及动物实验，其面临的主要问题是如何发现并解决致病靶基因，提高基因转染率，确定转向导基因载体，进行基因表达调控[6]。细胞移植是当前治疗心脏疾病的新型研究策略，多种细胞类型已用于临床研究，其中以骨髓干细胞具有独特的增殖、多向分化作用，可转为心肌细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞，但细胞-细胞、细胞-细胞外基质间的作用，会影响细胞分化，且细胞存活率也受到临床重点关注。故此，在基因修饰下进行细胞移植，在体外对细胞进行基因转染，可有效调控基因表达，降低基因表达的失控率，提高基因疗法的安全性；同时移植细胞经基因修饰，可提高移植细胞的存活率及存活功能。两者相互补充、相互作用，将骨髓干细胞作为载体，结合基因修饰作用，能够发挥潜在的治疗优势[7]。

在心力衰竭病理状态下，肌浆网钙离子ATP酶2a基因mRNA丰度、蛋白表面明显降低，使Ca2+的稳态及活动异常，致心肌收缩力降低。肌浆网钙离子ATP酶主要分布在心肌肌浆网，可调整心肌细胞内钙离子的稳定及活动，与心肌收缩、舒张功能密切相关，且参与了心肌细胞电节律、凋亡等生理活动[8]。肌浆网钙离子ATP酶2a基因作为治疗心力衰竭的新型靶基因，在机体生理状态下，会消耗ATP逆浓度，将胞浆内Ca2+转移至肌浆网，同时在磷酸化时，可使受磷蛋白（PLM）肌浆网钙离子ATP酶2a基因复合物结缔，增强对Ca2+的亲和性[9]。但其表达率、转染率的控制，仍影响着临床治疗。骨髓干细胞治疗策略可提高心力衰竭的心脏功能，缩小梗死面积，增加室壁厚度，但细胞存活率较低。故采用钙离子ATP酶2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗策略，利用钙离子ATP酶2a基因转染骨髓干细胞后，成功组装并表达钙离子ATP酶2a基因蛋白，以此发挥基因疗法及细胞移植的作用[10]。本组研究中，治疗21d，C组骨髓干细胞移植存活率为98%，高于B组的72%，B、C组的LVEF高于对照组，左室前壁、室间隔收缩与舒张期纵向峰值速度高于对照组，其中C组较A、B组升高明显（P≤0.05）。A、C组肌浆网钙离子ATP酶2a基因及蛋白表达明显高于B组、对照组，其中C组表达提高明显（P≤0.05）。研究提示，较单纯基因疗法、细胞移植策略相比，钙离子ATP酶2a基因转染骨髓干细胞治疗慢性心力衰竭，可显著恢复大鼠的心功能，具有更为稳定、持久的作用效应，且骨髓干细胞移植能够有效调控基因表达；而基因修饰能够提高移植细胞存活率及治疗效应。

4 结论

钙离子ATP酶2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗大鼠慢性心力衰竭具有一定效果，心脏功能改善明显，将骨髓干细胞作为治疗基础的细胞载体，以基因修饰细胞，两者相互作用，可提高其治疗作用。