运输应激对小鼠脾脏HSP70、TNF-α及IL含量的影响

王安平 ， 彭侃霖 ， 肖 鹏 ， 彭瑞妮 ， 李国生 ， 郑文亚,2,3

(1. 宜春学院生命科学与资源环境学院 ， 江西 宜春 336000 ; 2. 江西省高等学校硒农业工程技术研究中心 ， 江西 宜春 336000 ; 3. 江西绿科农牧科技有限公司 ， 江西 宜春 336000)

随着国内集约化养殖程度不断提高，畜禽的长途运输十分常见，而运输本身是一种应激压力[1]。运输涉及到动物隔离、活动受限、身体失衡、环境温度和湿度的波动、饲料和水的缺乏以及其他应激诱导因素[2]。这些因素共同作用在畜禽上，诱导动物产生应激，对畜禽的免疫、呼吸、消化和神经等系统产生不良影响，降低畜禽的经济价值，给养殖场造成经济损失。

白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由Th1细胞产生的细胞因子，二者都为促炎因子；白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)是由Th2细胞合成的细胞因子，IL-4有抗炎作用，而IL-6是具有促炎和抗炎双重作用的细胞因子[4]； 热休克蛋白70(HSP70)参与细胞的应激保护，在应激条件下表达会增加，具有调节免疫应答的作用。本试验以小鼠为实验动物，模拟运输应激对脾脏的影响，探究热休克蛋白(HSP70)、白细胞介素(IL-2、IL-4和IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平的变化与运输之间的关联，并筛选出可能的应激评判分子指标，为降低畜禽运输应激提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用清洁级雄性8～9周龄ICR小鼠30只，体重(30±5)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养环境温度(23±1)℃，采食和饮水自由。适应性饲喂10 d后进行试验。

1.2 主要仪器及试剂 小鼠IL-2、IL-4、IL-6、HSP-70、TNF-α酶联免疫分析试剂盒，均购自青岛生物科技有限公司。飞鸽牌低速台式离心机(型号：TDL-60B)，购自上海安亭科学仪器厂；美国酶标读数仪(型号：Awareness Chromate 4300)和超低温冰箱(ThermoScientific)，均购自江西省立康科技有限公司；微量振荡器(型号：MH-2)，购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；恒温培养震荡器(型号：ZWY-211C)，购自上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 试验设计 将30只小鼠随机均分成3组，对照组、处理组1和处理组2，对照组不处理，将处理组1和处理组2的小鼠分装至有盖鼠笼中，放入恒温培养震荡器中，在35 ℃、160 r/min条件下分别持续处理2 h和6 h。处理结束后立即处死，无菌摘取脾脏放入液氮速冻，然后放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.4 检测指标及方法 细胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量均采用双抗夹心法,参照ELISA试剂盒说明书进行检测，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，以标准品的OD值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线并得出线性回归方程，根据脾脏样品测得的OD值，计算出细胞因子和HSP70的含量。

1.5 数据处理 采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，试验数据均以“平均数±标准误”表示，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著；对各组数据进行LSD多重比较，同一行中小写字母标记相同的组之间表示差异不显著(P>0.05)；同一行中小写字母标记不同的组之间则表示差异显著(P<0.05)

2 结果

应激后小鼠出现明显的运输应激临床症状，如不安、狂躁、颤抖，被毛杂乱等。通过检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量，结果显示，与对照组相比，处理组1和处理组2的IL-2含量均有升高趋势，但差异均不显著(P>0.05)；处理组1的IL-4含量与对照组相比显著降低(P<0.05)，处理组2的含量下降，但无显著差异(P=0.083)；处理组1、2与对照组之间IL-6和HSP70含量均无显著差异(P>0.05)；处理组1与对照组相比TNF-α含量有升高趋势，但差异不显著(P>0.05)，处理组2的含量则显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 小鼠脾脏IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和HSP70的水平

3 讨论

本试验以小鼠为对象，模拟了实际运输过程中应激源对动物生理状态的影响。试验结果显示，模拟运输后，小鼠出现明显的临床症状，细胞因子水平发生了变化，这提示运输应激影响着动物的状态。在实际运输中，应激源来源众多，对机体的影响较为复杂，畜禽比如牛可能因此受到多种损伤，尤其是犊牛在应激条件下免疫力下降，极易感染多种传染性疾病[5]。牛呼吸道系统疾病(BRD)是一个复杂的疾病，其特征是原发性病毒感染，然后是继发性细菌感染。BRD涉及的病毒有牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和疱疹病毒1型(BoHV-1)等[6]。BoHV-1又称牛传染性鼻气管炎病毒，是造成牛经济损失的重要病毒之一。有研究表明，BRD的发病机制是BoHV-1先感染肺部，促炎细胞因子(IL-2、TNF-α)显著升高，细菌随后侵袭肺部，数小时内发生脓毒症，死亡率为30%～70%[7-9]。BRSV的发病机制与细胞因子的不同表达谱有关，其抵抗力可能与促炎细胞因子的表达水平有关，尤其是TNF-α、IL-4和IL-6[10]。因此应该重视运输应激给畜禽如牛、羊带来的健康问题，研究细胞因子与运输应激引起疾病的关系，为更好的预防疾病提供可靠依据。

脾脏是重要的外周免疫器官，有产生淋巴细胞的功能，观察应激后脾脏细胞因子表达的变化及其调控机制，可以进一步深入阐明运输应激对小鼠免疫功能的影响。本试验结果显示，与对照组相比，运输应激2 h组脾脏组织中IL-4含量显著降低(P<0.05)， 运输应激6 h组也降低(P=0.083)，而IL-4是辅助体液免疫和抗炎的主要细胞因子，说明机体的体液免疫受到一定抑制，且对脾脏可能产生一定的炎性反应。司鸿飞[11]的研究表明，从分离出来的淋巴细胞内检测，架子牛运输组与不运输组相比，IL-4浓度极显著降低，也证实了运输应激对机体免疫系统的影响。有研究表明，运输应激会导致试验肉牛血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)、IFN-γ、IL-2浓度升高，TNF-α浓度降低[12]。运输后猪的免疫机能发生变化，但运输应激对免疫机能的影响存在一定的时效性[13]。袁建彬等[14]的研究表明，不同时间的运输应激可导致肝脏和脾脏中HSP70与C反应蛋白(CRP)的浓度升高，可作为肉牛运输应激候选诊断标志物，说明脾脏对运输应激的影响有一定的标志意义。本试验发现，与对照组相比，运输应激6 h组脾脏组织中TNF-α含量显著升高(P<0.05)， 2 h时其变化并不显著，说明随着运输时间的延长，其对TNF-α含量变化有一定影响，TNF-α在一定的病理状态(如慢性炎性疾病)下产生增多，其增高预示着对正常免疫功能的破坏，且脾脏可能产生了一定的病理变化。

综上所述，运输应激会导致小鼠脾脏中IL-4含量降低和TNF-α含量升高，其中2 h运输应激导致IL-4含量显著降低，6 h的运输应激导致TNF-α含量显著升高，这提示运输对小鼠免疫功能有影响，脾脏IL-4和TNF-α的水平可以作为小鼠运输应激的候选评判分子指标。