高效液相色谱法测定赶黄草中槲皮素的含量

钟茂团，何德中，林剑，钟小莉

（四川逢春制药有限公司，四川 中江）

0 引言

随着对中医药学研究的增多，加之药物检测技术的不断发展进步，使得中药有效成分的研究取得了较大成效。通过测定不同中药中有效成分的含量，能够更好地控制中药制剂的质量。赶黄草为虎耳科植物扯根菜的干燥全草，临床用于保肝退黄，制剂厂家用于生产肝苏颗粒、肝苏糖浆等。标准收载于《湖南省中药材标准》2009 年版[1]，标准中没有含量测定。笔者参考肝苏颗粒，用高效液相色谱法测定槲皮素的含量，结果专属性强、耐用性好、精密度高，认为此法可用于测定赶黄草中的槲皮素含量。具体实验方法如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，紫外分光光度计，电子分析天平，槲皮素对照品由中检院提供，其余试剂为分析纯。

2 检测波长

取槲皮素对照品溶液（浓度为10.0μg/ml），在200-600nm 波长处进行扫描，最大吸收波长为370nm，所以选择检测波长为370nm。

3 测定条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%磷酸水（45 ∶55）为流动相，流速1.0ml/min，检测波长370nm。理论板数按槲皮素峰计不低于1800。

4 供试溶液的制备

4.1 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥24h 的槲皮素对照品0.01250g，置于250ml 量瓶中，用50% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml 量瓶中, 用50% 甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml 中含槲皮素10μg）。

4.2 提取溶剂的选择

取赶黄草药材细粉适量，共4 份，分别加10%盐酸甲醇溶液、2.3% 盐酸甲醇溶液、1% 盐酸甲醇溶液、甲醇溶液，加热回流3h，比较含量变化，结果：用2.3%盐酸甲醇溶液作提取溶剂，药材中槲皮素的提取较完全。结果见表1。

表1 提取溶剂的考察结果

4.3 提取方法的考察

取赶黄草药材细粉适量，共2 份，分别用两种方法：（1）用2.3%盐酸甲醇溶液回流提取3h；（2）用2.3%盐酸甲醇溶液浸泡24h，置索氏提取器中，85℃水浴加热回流3h，对样品进行处理，比较含量变化，结果：采用方法2 提取更完全。见表2。

表2 提取方法的选择

5 线性范围的考察

精密称取经五氧化二磷干燥24h 的槲皮素对照品0.01250g，置250ml 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该对照品溶液0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml 于7 个10ml 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，分别精密吸取20μl 注入高效液相色谱仪，测定，峰面积分别为109.69、224.38、459.54、900.34、1358.21、1785.32、2230.52，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归处理，得回归方程：A=89.211C+6.0906（n=7）,γ=0.9999。结果：槲皮素在1.25-25μg 之间呈良好的线性关系。

6 重复性试验

取同一批号样品6 份，按供试品溶液制备方法制备，依法测定槲皮素含量，平均值为0.6483mg/g，RSD=0.77%；见表3。结果：本方法的重复性良好。

表3 重复性试验

7 精密度的考察

取槲皮素对照品溶液（浓度为10μg/ml），重复进样5 次，测定峰面积，峰面积分别为900.34、906.08、901.17、901.39、908.87，平均值为903.57，RSD=0.41%。结果：精密度良好。

8 加样回收实验

分别精密称取同批样品约0.5g（已知槲皮素含量为0.6483mg/g），置于6 个索氏提取器中，并在对应的平底烧瓶中，分别精密加入槲皮素对照品(32μg/ml)10.0ml,按上述供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，测定含量，计算回收率，结果回收率分别为(%)：96.42、97.38、95.81、96.93、97.24、95.31。结果：回收率在95%-98%之间，加样回收均良好。

9 稳定性试验

将上述同批号的样品按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。分别于0h、2h、4h、6h、8h 精密吸取该供试品溶液20μl 注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，结果峰面积分别为895.519、882.104、915.126、871.233、912.083，平 均 值 为895.273，RSD（%）为2.11。结果：在本实验条件下，槲皮素含量在8h 内稳定。

10 耐用性试验

将上述同批号的样品按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。分别用同一类型不同厂家的色谱柱、在不同的柱温、不同流速、不同进样量条件下测定含量。结果：理论塔板数及分离度均达到要求，且含量结果无显著性差异。

11 讨论

中药材赶黄草具有利水除湿、祛瘀止痛的功效，可用于黄疸、跌打损伤、水肿等情况的治疗[2,3]。槲皮素为赶黄草中的一种有效成分。近年来随着对中医药学研究的增多，也发明出了很多中药制剂，而对药物中有效成分含量进行测定则是保障药物治疗的重要措施[4-6]。为了测定赶黄草中槲皮素的含量，本研究使用了高效液相色谱法，这是测定药物有效成分含量的常用方法[7,8]。研究结果表明，槲皮素在1.25-25μg/ml 之间呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.52%，RSD 为0.85%(n ＝6)，说明高效液相色谱法准确性高，可用于测定赶黄草中槲皮素的含量[9,10]。