高通量筛选策略在细胞色素P450单加氧酶定向进化中的应用

李敏奇, 谢凌志, 陈永正, 袁伟成*

(1. 遵义医科大学 a. 药学院； b. 贵州省生物催化与手性药物合成重点实验室；c. 贵州省教育厅绿色制药工程研究中心，贵州 遵义 563000 )

细胞色素P450单加氧酶是来源最广泛的酶家族之一，普遍存在于原核生物和真核生物，并参与生物体内众多代谢反应，如甾醇和萜类化合物合成与修饰[1]。P450单加氧酶具有催化活性混杂性的特点，可催化羟化反应，环氧化反应和脱烷基化反应等许多氧化反应(Scheme 1)，因而在生物催化和合成生物学领域展现出极具吸引力的应用前景。然而，目前P450单加氧酶在生物催化方面仍然面临着许多瓶颈问题，例如：反应活性低、选择性不高以及催化稳定性差[2]。20世纪90年代Arnold等开发了酶体外定向进化技术，并广泛应用于许多生物酶催化性能的提升。通过定向进化可实现P450单加氧酶的催化活性、区域选择性和立体选择性等催化性能的改善，甚至可以改变P450单加氧酶的催化机制，实现更多非天然的生物催化反应[3]。

Scheme 1

在酶的定向进化过程中往往需要寻找一种有效的基因突变策略来建立一个丰富的突变体文库，常用引入突变基因的方法有易错PCR、定点饱和突变、DNA重组和DNA交错延伸等。除此之外，由于突变体文库样本量巨大，针对特定酶催化反应的定向进化还需建立一个与之对应的高通量筛选策略，用于从庞大的突变文库中快速和准确地发现优良突变体。传统的GC和HPLC分析方法虽然准确性高，但其筛选效率低，成本高。P450单加氧酶催化的反应类型多、底物谱广泛，导致了高通量筛选策略的差异性较大，如何建立一种高效的筛选策略是P450单加氧酶成功定向进化的关键。本文综述了P450单加氧酶在定向进化过程中高通量筛选策略的最新进展。

1 比色法筛选策略

1.1 NAD(P)H比色法

目前已知的绝大多数P450单加氧酶是NAD(P)H依赖型，还原态的NAD(P)H在340 nm处有最大吸收峰，当其参与P450单加氧酶催化氧化反应后，转化为氧化态的NAD(P)+，后者在340 nm有较弱的吸收值。因而，通过在340 nm处定量检测NAD(P)H消耗量，即可反应出P450单加氧酶的催化反应活性(Scheme 2)[4]。2002年，Gianfranco等通过P450BM3催化不同类型的底物证实了这一策略可被用于高通量筛选[5]。同年，Arnold等运用此高通量方法对P450BM3催化的烷基羟基化活性进行定向进化，成功获得了突变体P450BM3 139-3，其与野生型相比己烷羟基化的活性提高了35倍以上。作者以P450BM3 139-3为亲本进一步进行定向进化，成功获得了另一突变体P450BM3 1-12G，其对丙烷的周转率相较于亲本提高了12倍(Scheme 2a)。

P450单加氧酶在催化过程中存在解耦合反应，生成副产物过氧化氢，使得NAD(P)H的消耗没有全部用于底物转化，从而导致该高通量筛选策略会出现假阳性[8]。为了解决这一问题，Bornscheuer等使用AmplifluidRed为指示剂，通过辣根过氧化物酶(HRP)催化生成荧光素试卤灵来定量过氧化氢的生成量，用于计算耦合效率，来提高筛选的准确性[9]。

1.2 对硝基苯酚比色法

对硝基苯酚比色法原理是基于末端羟基化产物为不稳定半缩醛，在室温下发生氧化反应，生成黄色对硝基苯氧基离子，后者在410 nm处具有特征吸收峰(Scheme 3)。 Schmid等利用P450单加氧酶可催化脂肪酸替代底物对硝基苯氧基羧酸盐(pNCA)末端羟基化生成半缩醛的反应，建立高通量筛选方法，通过比较P450BM3 F87A与野生型的催化活性，验证其在筛选过程中的灵敏度与可行性。基于该高通量筛选策略，Schmid等对P450BM3 F87A催化8-pNCA(辛酸的替代底物)羟基化反应进行定向进化，成功筛选到突变体P450BM3 F87A/L188K/A74G/R47F，其催化效率从不可检测提高至8.8 s-1(Scheme 3a)[11]。随后，对硝基苯氧基离子的筛选方法还被应用于其他P450单加氧酶的定向进化，改善P450单加氧酶对天然底物的催化活性、热稳定性[12]、过氧化氢耐受性[13]、共溶剂耐受性，以及电子转移效率[15]。

此外，Farinas等采用新型替代底物对硝基苯基醚(8-pNPE)建立高通量筛选方法，用于P450BM3催化直链烷烃羟基化的定向进化，作者运用此高通量筛选方法经过两轮筛选，成功获得突变体P450BM3 VIII2C9，其催化末端羟基化的活性相较于野生型提高了5倍(Scheme 4)[16]。

Scheme 2

Scheme 3

Scheme 4

Scheme 5

1.3 对硝基苯硫酚比色法

对硝基苯硫酚(pNTP)是一种黄色化合物，在450 nm处有特征吸收峰。pNTP可自发进攻环氧发生开环反应，形成无色的开环产物(Scheme 5)。Schwaneberg等首次利用pNTP建立高通量筛选策略，完成了对P450BM3催化苯乙烯环氧化活性的定向进化，成功筛选获得突变体P450BM3 5F5184K，其相较于亲本P450BM3 5F5不对称环氧化活性提高2倍(Scheme 5a)[17]。

1.4 副玫瑰红比色法

副玫瑰红是一种红色试剂，可与亚硫酸发生脱水缩合反应生成席夫碱，后者可与甲醛反应生成紫色的副玫瑰红衍生物，该衍生物在540 nm处具有特征吸收峰(Scheme 6)。CYP102D1催化大豆黄酮邻位羟基化与其催化的O-脱羰基化的反应活性存在线性关系(Scheme 6a)，从而可通过烷基化反应活性反映其双羟基化活性。Kim等利用了这种特性建立了一种基于副玫瑰红的固相高通量筛选策略，用于CYP102D1催化大豆黄酮邻位特异性双羟基化反应的定向进化，筛选获得突变体CYP102D1 F96V/M246I，与野生型P450酶相比，突变体对大豆黄酮羟基化的反应产率从无法检测提升到5.4%的产率。进一步的突变筛选获得了突变体CYP102D1 G1，其可催化3-位羟基化反应，并表现92%区域选择性，但是羟基化的活性仍然不高[18]。作者在突变体CYP102D1 F96V/M246I的基础上进一步定向进化，最终筛选得到突变体P450102D1 M8，其羟基化活性相较于亲本提升了23倍，区域选择性大于80%(Scheme 6b)。

Scheme 6

1.5 4-硝基苯乙腈比色法

4-硝基苯乙腈(NpCN)是一类醌类、苯二酚(HQ)类和邻苯二酚类化合物检测剂，NpCN在氧气与碱性条件下可与以上化合物发生加成反应生成有色产物，后者可在特定的波长下被定量检测(Scheme 7)。 Schwaneberg等报道了基于NpCN的高通量筛选方法对P450BM3催化苯环原位双羟基化反应的定向进化，成功筛选获得了突变体P450BM3 AW2，其催化假枯烯二羟基化的活性相较野生型提升了70倍(Scheme 7a)[20]。

1.6 靛蓝比色检测

有些P450单加氧酶可催化吲哚发生3-羟基化反应，生成3-羟基吲哚，后者在氧气条件下自发氧化二聚形成水不溶的蓝色沉淀物靛蓝，其在600～675 nm处具有特征吸收峰(Scheme 8)。 WU等基于细胞色素P450 2A6可催化吲哚羟基化形成靛蓝的特性，以吲哚衍生物4-氯吲哚建立高通量筛选方法。经两轮固相筛选，作者成功筛选获得突变体P450 2A6 St9与野生型相比kcat/Km值提升了5倍，kcat提升了2倍(Scheme 8a)。 Turner等使用靛蓝预筛P450cam饱和突变文库，并成功获得了突变体P450cam Y96M，实现了P450cam催化非吲哚类似物二苯甲烷的羟基化(Scheme 8b)[22]。

Scheme 7

Scheme 8

1.7 Purpald比色法

4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(Purpald)是一种无色试剂，在氧气存在时其可与甲醛发生成环反应，生成紫色的Purpald衍生物，后者在550 nm处具有特征吸收峰(Scheme 9)。 Arnold等利用P450可催化二甲醚脱甲基生成甲醛可进一步与Purpald发生显色反应建立高通量筛选方法。基于该高通量筛选策略，作者先后分别对P450BM3催化丙烷羟基化和正辛烷羟基化反应的定向进化，成功筛选获得活性改良的突变体P450BM3 9-10A；进一步筛选获得突变体P450BM3 35-E11，其相较于P450 BM3 9-10A周转率提高了6倍(Scheme 9a)[23]。随后，作者进一步对P450 BM3 9-10A进行定向进化，成功获得了突变体P450BM3 77-9H，对辛烷末端羟基化表现52%的区域选择性(Scheme 9b)[24]。此外，Purpald分析法被运用于P450单加氧酶催化短链醇羟基化[25]和棕榈酸末端羟基化的定向进化[26]。

Fasan等运用Purpald比色法发展了一种指纹图谱分析策略，通过检测甲醛的生成来报告反应的活性，结合底物与活性部位构象，建立反应性能、底物骨架和蛋白结构三者之间的指纹图谱(Scheme 10)。作者利用P450BM3及其突变体催化甲氧基化探针验证指纹图谱策略可行性，并且发现突变体P450BM3 FL#62在催化5种非甲基化底物时均表现出了优异的催化活性和区域选择性(Scheme 10a)[27]。在随后对P450BM3催化不对称氨基化活性进行分析时，进一步证实了突变体P450BM3 FL#62对于分子骨架较大的底物也表现出较高的氧化活性(Scheme 10b)[28]。

Scheme 9

Scheme 10

Scheme 11

Scheme 12

1.8 硝基蓝四唑-吩嗪硫酸甲酯比色法

在吩嗪硫酸甲酯(PMS)存在下，硝基蓝四唑(NBT)可与NAD(P)H发生反应生成不溶的蓝紫色产物甲瓒(Formazan)，后者在580 nm处具有特征吸收峰(Scheme 11)[29]。Li等运用此筛选策略实现了对P450pyr不对称羟化对映体选择性和区域选择性的高通量分析。作者利用脱氢酶将P450单加氧酶不对称羟化的产物转化为酮化合物，同时生成NADH，再利用NBT-PMS分析法间接测量NADH，进而可对羟基化产物进行定量分析。作者运用此筛选策略对P450pyr进行定向进化，成功筛选获得了突变体P450pyr 11BB12，催化1-苄基吡咯烷不对称羟化 (S)-立体选择性从43%提升到65%，另一突变体P450pyr 1AF4A表现83%(R)-立体选择性(Scheme 11a)[30]。

此外，Li等还利用NBT-PMS高通量筛选策略，成功获得高立体选择(98%)且高区域选择性(99%)催化正辛烷次末端羟化的突变体P450pyr SM1。同时，作者也获得了可催化苯丙烷次末端羟基化的突变体P450pyr SM2，其表现95% (S)-立体选择性和98%区域选择性(Scheme 12)[31]。

1.9 4-氨酰安替比林比色法

4-氨酰安替比林(4-AAP)是一种酚类检测试剂，在过硫酸盐存在时可与苯酚发生氧化反应，生成红色的4-AAP类似物，后者在509 nm处具有特征吸收峰(Scheme 13)。Schwaneberg等将P450BM3催化苯氧基脂肪酸末端羟基化释放苯酚的特性，与4-AAP比色法相结合建立了高通量筛选方法(Scheme 13a)。基于此高通量筛选方法，作者成功筛选得到突变体P450BM3 1E7，其对3-甲基二苯醚的羟基化活性较于野生型提高8.2倍(Scheme 13b)。除此之外，Schwaneberg等发现4-AAP筛选策略同样适用于在苯环上原位羟基化而产生酚类化合物的高通量分析。

Scheme 14

Scheme 15

1.10 4-(4-硝基苄基)吡啶比色法

4-(4-硝基苄基)吡啶(NBP)是一种亲核试剂，在碱性条件下自发进攻环氧发生开环反应，生成紫色NBP衍生物，后者在600 nm处具有特征吸收峰(Scheme 14)， Arnold等基于此反应建立了高通量筛选方法。作者通过比较突变体P450BM3 139-3与野生型P450BM3催化苯乙烯环氧化活性与其在600 nm处吸光值的关系，验证该方法的灵敏度及可行性，证明了该方法可用于筛选高环氧化活性的P450单加氧酶突变体(Scheme 14a)[34]。

Scheme 16

Scheme 17

1.11 苦味酸比色法

苦味酸是一种亲核试剂，可选择性进攻16,17-环氧甾醇环氧部位发生开环反应，生成橙色苦味酸衍生物，后者在490 nm处具有特征吸收峰(Scheme 15)。Wang等基于此反应建立高通量筛选方法，用于对P450BM3催化的黄体酮环氧化反应进行定向进化，成功筛选获得可催化黄体酮生成16,17-环氧甾醇的突变体P450BM3 5-B10(Scheme 15a)[35]。

1.12 底物/产物比色法

底物/产物比色法筛选策略是基于底物/产物之间存在明显的红移或者蓝移现象而建立的一种筛选策略(Scheme 16)， Arnold等基于此特性建立了高通量筛选方法。基于该高通量筛选策略，作者对P450BM3突变体P411催化的1-甲基吲哚卡宾插入反应进行定向进化，成功筛选得到了一个含有11个突变位点的突变体，其催化生成N-甲基-3-吲哚乙酸乙酯的转换频率和总转换数分别为470 min-1和18000次[36]。

2 基于荧光分析筛选策略

2.1 试卤灵荧光法

试卤灵是一种荧光剂，激发波长和发射波长分别为530 nm和580 nm(Scheme 17)。Commandeur等利用P450BM3可催化7-烷氧基试卤灵O-脱烷基化生成试卤灵建立高通量筛选方法，对P450BM3的有机溶剂耐受性进行定向进化，成功筛选获得了对甲醇、乙腈和异丙醇三种溶剂耐受性增强的突变体P450BM3 MT111和MT112(Scheme 17a)[37]。

2.2 2-乙酰基苯并呋喃-Peroxyfluor-1荧光法

2-乙酰基苯并呋喃(2-ABF)可与NAD(P)+发生环化反应生成强荧光产物，后者的激发波长和发射波长分别为421 nm和480 nm (Scheme 18)[38]。但此分析方法同样存在因解耦合产生假阳性的问题，Takahashi等将2-ABF荧光法与Peroxyfluor-1分析方法(H2O2荧光检测试剂)相结合建立高通量筛选方法。作者将该高通量策略用于对P450BM3催化的甾体羟基化反应进行定向进化，成功筛选获得突变体P450BM3 F87A/A330W，实现了P450BM3对非天然底物甾体的高区域和立体选择性羟基化(Scheme 18a)[39]。

2.3 ABTS荧光法

2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)是一种介体物质，在辣根过氧化物酶(HRP)催化下与H2O2发生反应生成荧光产物ABTS2+，后者的激发波长和发射波长分别为340 nm和414 nm (Scheme 19)。Hauer等采用双酶级联的筛选思路，利用P450单加氧酶催化脂肪酸末端羟基化得到的氧化产物与半乳糖氧化酶进一步发生氧化反应生成醛酸和H2O2的反应特性建立高通量筛选方法。基于此方法，作者成功筛选获得突变体P450 153A S453A相较于亲本P450 153A G307A催化脂肪酸末端羟基化活性提升了0.16倍(Scheme 19a)[40]。

2.4 香豆素荧光法

香豆素荧光法是通过P450单加氧酶催化脱烷基化反应释放荧光产物7-羟基香豆素，后者的激发波长和发射波长分别为405 nm和460 nm (Scheme 20)。Vlada等运用此筛选策略建立高通量分析方法用于对CYP116B3的进行定向进化，成功筛选得到突变体CYP116B3 74H10，其催化7-乙氧基香豆素O-脱乙基化活性增加240倍，另一突变体CYP116B3 70A0对7-甲氧基香豆素的O-脱甲基化活性增加13倍[41]。此外，Akira等基于此高通量筛选策略对P450moxA催化O-脱乙基化活性进行定向进化，成功获得活性提升20倍的突变体P450moxA-Q37W/T115A/H132L/R191W/G294D，同时发现此突变体对催化与香豆素构象差异较大的底物(双氯芬酸和柚皮苷)的活性也有明显的提升(Scheme 20a)[42]。

Scheme 18

Scheme 19

Scheme 20

Scheme 21

Scheme 22

Scheme 23

Scheme 24

P450BM3可催化7-苯并氧-3-羧香豆素乙酯(BCCE)发生O-脱烷基反应生成荧光香豆素衍生物，后者的激发波长和发射波长分别为400 nm和440 nm (Scheme 21)。Schwaneberg等以此反应为基础首次建立了基于流式细胞术的P450单氧化酶高通量活性分析平台。经过一轮定向进化，作者筛选得到突变体P450BM3 DM-1，其较亲本P450BM3 DM的催化活性增加7倍[43]。

2.5 吉布斯分析法

吉布斯分析法是一种通过酚类化合物自身偶联或者与吉布斯试剂发生偶联反应产生荧光或紫外可见吸收的分析法(Scheme 22)。Arnold等基于此建立高通量分析方法并用于对P450cam的定向进化，成功筛选获得突变体P450cam M7-8H，催化萘羟基化活性相较于亲本提升了20倍(Scheme 22a)[44]。

2019年，Schwaneberg等首次将多路毛细管分析法运用于P450单加氧酶催化异佛尔酮羟化活性的高通量分析(Scheme 23)。通过将该分析方法与NAD(P)H比色检测法相比较，作者发现该高通量方法较NAD(P)H筛选法的筛选时间延长了4～6倍，但准确性得到了很大改善[45]。

质谱法是一类基于分子量测定的分析技术，Keasling等通过底物探针类似物的巧妙设计，成功将纳米结构-引发剂质谱运用于P450单加氧酶催化活性的高通量分析。作者将该高通量筛选方法用于对P450BM3催化朱栾倍半萜羟基化反应的定向进化，成功筛选获得了可催化朱栾倍半萜羟基化反应的P450BM3突变体F87A, F87G, F87I, F87P 和 F87G/A238G(Scheme 24)[46]。

Li等以底物的同位素标记探针设计为基础，建立了高通量质谱分析方法，并用于P450pyr催化1-苄基吡咯烷不对称羟基化的对映选择性高通量分析(Scheme 25)。作者运用此筛选策略成功得到突变体P450pyrTM，与野生型P450相比，其对此底物不对称羟化的(S)-立体选择性从53%提升到98%，区域选择性由90%提升到100%[47]。

P450单加氧酶的高通量筛选方法以紫外-可见比色法为主，NAD(P)H比色法尽管存在解耦合等问题，但仍然是应用最广泛的高通量筛选方法。此外，通过反应设计，引入或消耗生色基团的高通量筛选策略也常用于P450单加氧酶的定向进化，但这些分析方法仅限用于末端羟基化反应或者广义上针对生色基团邻位C—H键的羟基化反应，如pNCA、pNPE、Purpald等。除此之外，荧光分析筛选策略在提升催化活性领域也有许多运用，如针对氢过氧化物的检测以及荧光产物的检测等。其他高通量筛选方法，如多路毛细管筛选策略和高通量质谱法，虽然准确性较高，但对分析设备具有较高的要求。然而，目前针对区域选择性和立体选择性的高通量筛选方法较少，而且这些高通量筛选方法的特异性强，通用性差。随着对P450单加氧酶定向进化的不断研究，将会产生更多的高通量筛选方法，总结和归纳这些策略有利于加快P450单加氧酶定向进化的深入发展，从而促进P450单加氧酶在生物催化领域更广泛的应用。

Scheme 25