细菌脂多糖通过MAPK/ERK1/2信号通路影响成骨细胞活性和凋亡

孙 勃 刘士波 王 培 薛鑫鑫 高云峰 付世杰

(承德医学院附属医院手足外科，承德 067000)

近年来，骨质疏松和骨折患者的发病率不断升高，骨愈合需要比较长的周期，因此促进骨愈合对于骨质疏松和骨折患者的治疗具有重要意义。由感染所致的内毒素血症以及创伤引起的骨感染均可造成骨坏死，感染性骨坏死是骨科领域研究的难点和热点问题。但感染性骨坏死的机制尚不十分清楚，因此探讨骨坏死的机制对早期预防和治疗骨坏死具有重要意义。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌主要的致病成分，可引起组织细胞的功能紊乱，研究发现LPS可影响成骨细胞的增殖、分化和凋亡，延迟骨愈合[1，2]。MAPK/ERK1/2信号通路在成骨细胞的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，通过调控MAPK/ERK1/2信号通路可促进成骨细胞增殖和分化，抑制成骨细胞凋亡[3-5]。本文通过研究LPS对成骨细胞活性和凋亡以及MAPK/ERK1/2信号通路的影响，探讨LPS是否通过MAPK/ERK1/2信号通路影响成骨细胞活性和凋亡。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1(美国ATCC公司)，LPS、Hochest 33258(美国Sigma公司)，DEME/F12培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，ERK1/2激酶抑制剂U0126(德国Merck公司)，噻唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)活性测定试剂盒(美国invitrogen公司)，兔抗鼠C-Caspase 3单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗鼠Bax单克隆抗体、兔抗鼠ERK1/2单克隆抗体、兔抗鼠p-ERK1/2单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗等(美国Gibco公司)等。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将MC3T3-E1细胞接种到DEME/F12培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素)的96孔板中培养，3 d进行1次换液，细胞生长至80%以上融合时进行传代培养(传代比例1∶2)。

1.2.2细胞分组和处理 将第3代生长良好的MC3T3-E1细胞随机分为对照组、LPS组、LPS+U0126组，对照组不给予LPS处理，LPS组待细胞达65%贴壁生长时添加10 mmol/L LPS(研究证实LPS对成骨细胞的影响呈剂量和时间依赖性，本文参考相关文献[6，7]选择LPS剂量为10 mmol/L、作用24 h进行研究)，LPS+U0126组待细胞达65%贴壁生长时添加10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制剂U0126，继续培养24 h。

1.2.3采用MTT比色法测定细胞活性 将3组处理后的MC3T3-E1细胞置于DEME/F12培养基中培养，每组设7个复孔，培养24 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl培养4 h，移去上清液，加入二甲基亚砜100 μl振荡10 min溶解结晶，继续培养至气泡溶解，采用酶标仪测定每孔570 nm波长处吸光度值，以吸光度值表示MC3T3-E1细胞活性。

1.2.4流式细胞术测定细胞凋亡 将3组处理后的MC3T3-E1细胞经离心、收集、漂洗，加入Binding Buffer 100 μl制成细胞悬液，加入Annexin V-FITC 5 μl 混匀，再加入PI染色液10 μl孵育15 min，加入Binding Buffer定容到500 μl，上机，每份收集10 000个MC3T3-E1细胞计算凋亡细胞所占比例。实验重复7次。

1.2.5成骨活性指标ALP和BGP活性测定 取3组处理过的MC3T3-E1细胞，采用硝基苯磷酸二钠基质动力学法测定ALP活性；采用放射免疫法测定BGP活性。

1.2.6采用Hochest 33258染色观察细胞核形态 将3组MC3T3-E1细胞爬片放置到6孔板中，每孔2×105个细胞，培养至细胞达70%融合后，对照组不加入LPS处理，LPS组加入10 mmol/L LPS，LPS+U0126组加入10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制剂U0126，培养12 h，弃去培养基，PBS冲洗，加入多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗，用Hochest 33258染液5 μg/ml覆盖细胞爬片染色10 min，PBS漂洗，取出细胞爬片，在荧光显微镜下拍照观察细胞核形态。

1.2.7采用Western blot测定细胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平 将3组MC3T3-E1细胞接种到培养皿中，待细胞生长至90%融合时，对照组不加入LPS处理，LPS组加入10 mmol/L LPS，LPS+U0126组加入10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制剂U0126，培养24 h，将处理后细胞收集到EP管中，3 500 r/min离心5 min，共3次，弃去上清液，加入细胞裂解液裂解30 min，BCA法测定MC3T3-E1细胞蛋白浓度，经电泳、转膜、封闭后，加入一抗(兔抗鼠C-Caspase 3单克隆抗体、兔抗鼠Bax单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗鼠ERK1/2单克隆抗体、兔抗鼠p-ERK1/2单克隆抗体)(1∶1 000)过夜孵育，以β-actin为内参照，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育2 h，加入ECL显影，用凝胶成像系统拍照，采用Image Lab软件分析蛋白条带。目标蛋白水平以目标蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

2 结果

2.13组MC3T3-E1细胞活性比较 与对照组比较，LPS组和LPS+U0126组MC3T3-E1细胞活性降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+U0126组MC3T3-E1细胞活性升高(P<0.05)。见表1。

2.23组MC3T3-E1细胞凋亡比较 与对照组比较，LPS组和LPS+U0126组MC3T3-E1细胞凋亡率升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+U0126组MC3T3-E1细胞凋亡率降低(P<0.05)。见表2和图1。

2.33组MC3T3-E1细胞成骨活性指标ALP和BGP活性比较 与对照组比较，LPS组和LPS+U0126组MC3T3-E1细胞ALP和BGP活性降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+U0126组MC3T3-E1细胞ALP和BGP活性升高(P<0.05)。见表3。

GroupsnCell viabilityControl group7115.35±11.24LPS group761.24±9.031)LPS+U0126 group7 78.57±10.421)2)F50.666P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the LPS group,2)P<0.05.

GroupsnApoptosis ratesControl group76.24±1.47LPS group727.13±1.621)LPS+U0126 group713.16±1.511)2)F336.575P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the LPS group,2)P<0.05.

图1 3组MC3T3-E1细胞凋亡流式细胞图Fig.1 Apoptotic flow cytometry of three groups of MC3T3-E1 cells

2.43组MC3T3-E1细胞核形态比较 对照组细胞核完整，染色均匀，呈卵圆形或圆形；LPS组细胞核缩小，呈碎块状致密浓染的固缩状，染色质凝聚，呈明显的细胞凋亡形态；LPS+U0126组凋亡形态细胞数量明显减少。见图2。

2.53组MC3T3-E1细胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比较 与对照组比较，LPS组和LPS+U0126组MC3T3-E1细胞C-Caspase 3、Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+U0126组MC3T3-E1细胞C-Caspase 3、Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。见表4和图3。

2.63组MC3T3-E1细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比较 3组MC3T3-E1细胞ERK1/2比较差异无统计学意义(P>0.05)，p-ERK1/2蛋白水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中与对照组比较，LPS组和LPS+U0126组MC3T3-E1细胞p-ERK1/2蛋白水平升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+U0126组MC3T3-E1细胞p-ERK1/2蛋白水平降低。见表5和图4。

GroupsnALP(U/g)BGP(ng/ml)Control group76.84±1.250.53±0.06LPS group72.47±0.961)0.28±0.051)LPS+U0126 group74.21±1.131)2)0.39±0.071)2)F27.02629.973P0.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the LPS group，2)P<0.05.

图2 3组MC3T3-E1细胞核形态的Hochest 33258染色(×400)Fig.2 Hochest 33258 staining of nuclear of three groups of MC3T3-E1 cells (×400)

GroupsnC-Caspase 3 proteinBax proteinBcl-2 proteinControl group70.24±0.090.18±0.070.85±0.16LPS group70.47±0.121)0.49±0.141)0.19±0.131)LPS+U0126 group70.35±0.111)2)0.32±0.131)2)0.37±0.141)2)F8.03212.22539.362P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the LPS group，2)P<0.05.

图3 3组MC3T3-E1细胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白Western blot电泳图Fig.3 Western blot analysis of C-Caspase 3,Bax,Bcl-2 proteins in three groups of MC3T3-E1 cellsNote: 1.Control group；2.LPS group；3.LPS+U0126 group.

GroupsnERK1/2p-ERK1/2Control group70.42±0.150.13±0.06LPS group70.46±0.170.78±0.211)LPS+U0126 group70.52±0.190.31±0.141)2)F0.60835.146P0.5550.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the LPS group，2)P<0.05.

图4 三组MC3T3-E1细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白Western blot电泳图Fig.4 Western blot analysis of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in three groups of MC3T3-E1 cellsNote: 1.Control group；2.LPS group；3.LPS+U0126 group.

3 讨论

开放性骨折患者常伴随有细菌感染，细菌感染是引起骨折不愈合或延迟愈合的重要原因。骨折愈合过程是成骨细胞形成骨质，并且发生钙化的过程，细菌感染可引起骨折局部炎症细胞因子的释放，从而引起免疫功能紊乱，导致成骨细胞凋亡，使骨折愈合困难。LPS包含特异性多糖、非特异性多糖和类脂A，是细菌内毒素的关键成分，其中类脂A是关键毒性成分，可造成多种器官损伤、衰竭。LPS作为细菌的主要致热源，可使成骨细胞活性降低。炎症反应是机体防御外界损伤的主要机制，骨折后大量炎症因子的释放可造成破骨细胞活化、成骨细胞无法成骨，从而抑制骨折愈合[8]。LPA引起骨折不愈合主要为LPS引起的活化因子配基水平升高，使成骨细胞分泌破骨细胞激活因子，降低成骨细胞活性，并促进成骨细胞凋亡[9]。细胞实验研究发现：体外给予一定浓度的LPS可降低成骨细胞的增殖和分化能力，诱导成骨细胞凋亡[10]。

细胞凋亡的信号通路包括死亡受体通路、内质网通路、线粒体通路等，最为经典的通路为线粒体通路。线粒体凋亡途径主要通过Caspase、Bcl-2凋亡家族成员发挥作用，Caspase为细胞凋亡过程中发挥关键作用的半胱氨酸蛋白酶，Caspase-3在凋亡级联反应中发挥最关键作用，活化的Caspase-3促进凋亡的发生[11]；Bcl-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，可促进或防止凋亡因子从线粒体释放，破坏或保护线粒体完整性[12]；Bcl-2通过维持线粒体膜的完整性抑制细胞凋亡；Bax可破坏线粒体膜，形成通透性孔道，促进细胞凋亡[13]。ALP由成骨细胞分泌，是成骨细胞分化的标志，可反映成骨细胞功能和成骨细胞分化成熟程度；BGP由成牙骨质细胞和成骨细胞合成和分泌，是构成骨基质的成分之一，可反映成骨细胞分化成熟情况及成骨细胞的成骨功能；因此ALP和BGP活性可反映成骨细胞的成骨活性。本研究体外对小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1细胞给予LPS处理，发现LPS处理后MC3T3-E1细胞活性及ALP和BGP活性降低，凋亡率增加，细胞中C-Caspase 3、Bax蛋白水平升高、Bcl-2蛋白水平降低。表明LPS可抑制成骨细胞活性及成骨活性，诱导成骨细胞凋亡，分析LPS通过降低Bax蛋白水平，使细胞色素C进入细胞质，与凋亡相关因子-1等组成凋亡体，凋亡体激活下游Caspase 3，活化的Caspase 3(C-Caspase 3)水解底物，诱导成骨细胞凋亡。

多种信号通路参与成骨细胞增殖、分化和凋亡，MAPK为信号转导过程中的主要信号分子，在多种细胞生理病理过程中发挥重要作用[14，15]，ERK为MAPK信号通路之一，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用[16]。在成骨细胞中，ERK参与成骨细胞的分化、存活和增殖，抑制ERK1/2信号通路的激活可抑制Bax表达升高和Bcl-2下调，从而抑制线粒体释放细胞色素C，抑制Caspase-3激活，从而抑制细胞凋亡[17，18]。LPS可通过多种信号通路影响成骨细胞增殖、分化和凋亡[19]，如LPS通过Notch信号通路诱导成骨细胞增殖[20]；LPS通过JNK信号通路抑制成骨细胞分化和诱导成骨细胞凋亡[21]。本研究发现LPS可降低成骨细胞中p-ERK1/2水平，表明LPS可激活成骨细胞ERK1/2信号通路；细胞中同时加入ERK1/2信号通路抑制剂处理后，成骨细胞活性及ALP和BGP活性升高，凋亡率下降，C-Caspase 3、Bax、p-ERK1/2蛋白水平下降，Bcl-2蛋白水平升高。表明LPS可能通过促进ERK1/2信号通路的激活使Bax表达升高和Bcl-2下调，导致线粒体释放细胞色素C，激活Caspase-3，从而诱导成骨细胞凋亡。

综上所述，LPS可通过激活MAPK/ERK1/2信号通路介导线粒体通路抑制成骨细胞活性、诱导成骨细胞凋亡。