乳腺癌肿瘤微环境中HMGB1表达与MDSC的相关性

倪 萍，刘月琴，李 旺，苏兆亮，周成林*

（1.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300； 2.江苏大学免疫学研究所，江苏 镇江 212013；3.江苏大学第四附属医院，江苏 镇江 212001）

乳腺癌是威胁女性身心健康的一种常见恶性肿瘤，目前关于乳腺癌的发病机制及病因尚未明确阐述。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，其参与了肿瘤细胞的生殖、分化过程；而MDSC具有显著的抑制免疫细胞应答的能力[1]。研究表明，乳腺癌患者中HMGB1表达情况与MDSC具有一定关联性，但目前相关报道相对较少[2]。鉴于此，本研究主要分析乳腺癌中HMGB1表达与MDSC的相关性，旨在指导临床预测乳腺癌的发生风险。

1 材料与方法

1.1 材料

荧光定量P C R 试剂盒（大连宝生）；H M G B 1抗体（Abcam）、GAPDH抗体（南京凯基）；PCR引物（广州复能）；PE-anti-CD11b抗体、FITC-anti-Gr-1抗体（BD）。 BALB/C裸鼠，扬州大学动物中心购得。人乳腺癌MCF-7细胞系来自本研究室。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤鼠模型的建立

BALB/C裸鼠肩胛区皮下注射MCF-7 106-107细胞0.3 mL，2周后取肿瘤组织、脾脏和外周血。

1.2.2 流式细胞仪

将1×106细胞加入25 μLPBS中，分别加FITC标记的Gr-1抗体1 μL和PE标记的CD11b抗体2.5 μL，冰上孵育30 min，然后加入1 mL PBS，离心，重复2次。最后加200 μL PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测。

1.2.3 Western blot

10 g/L PMSF的裂解液制备总蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；PVDF转膜，脱脂奶粉封闭；HMGB1抗体（1：1000）4°C孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1：5000）孵育2 h，ECL法显色，用Bio-RAD凝胶成像系统来检测蛋白条带。

1.2.4 RT-qPCR

提取总RNA后逆转录成cDNA，RT-qPCR检测HMGB1表达，GAPDH作为内参照。25 μL体系，扩增条件为：95°C预变性15秒，95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸15秒，共40个循环。

1.3 统计学方法

Graphpad Prism5软件进行数据分析，两组比较采用Student’s t检验，Pearson分析相关性，P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MDSC的检测

荷瘤鼠脾脏和外周血中MDSC的比例高于正常对照组，差异有统计学意义（***为p＜0.001）,见图1。

2.2 癌组织中HMGB1水平

HMGB1蛋白水平（图2A）、mRNA，差异有统计学意义（图2B，P＜0.05）在癌组织中高表达。

2.3 癌组织中HMGB1和MDSC的相关性

相关性分析发现HMGB1和MDSC之间呈现正相关关系,见图3。

3 讨 论

HMGB1是一种高度保守的核蛋白，其可通过损伤、坏死的细胞释放至胞外，或者通过活化后的细胞释放至胞外。已有文献报道HMGB1与肿瘤的发生、发展相关；因此有望成为肿瘤治疗的新方向。MDSC是一种异质性细胞群体，其在感染、免疫抑制等病理中会阻碍MDSC分化成成熟细胞，致使其大量聚集在脾脏、外周血、病变部位等[3]，进而抑制机体免疫应答，促进肿瘤细胞生长、增殖。细胞核外的HMGB1促进趋化因子释放，还可诱导IL-6、TNF-α等炎性因子，导致MDSC积聚，进而加重机体免疫抑制反应，由此推测，HMGB1可能是调控MDSC的一个促炎因子[4]。此外，HMGB1可与MDSC表面上的RAGE受体与TLR-4受体结合，并通过NF-kB、P38MAPK、ERK1/2信号通路来调控MDSC分化，致使MDSC积聚，进而加强对T细胞、NK细胞的抑制作用，加重机体免疫应答抑制，促进肿瘤细胞增殖、生长，进而促进乳腺癌的发生、发展。

本研究结果显示，荷瘤鼠癌组织中HMGB1表达高于癌旁组织，荷瘤鼠脾脏和外周血中MDSC的比例也高于正常对照组，且HMGB1高表达与MDSC比例增加之间呈正相关。因此，我们推测可能是HMGB1调控MDSC的作用参与乳腺癌发生，但是乳腺癌中HMGB1是如何具体调控MDSC的以及具体的分子机制仍待证实。

综上所述，HMGB1在乳腺癌中呈现高表达且与MDSC的关系呈正相关，但是在乳腺癌发生、发展中HMGB1是如何调控MDSC分化的仍需研究。为以后乳腺癌的治疗提供新的作用靶点。