杞菊地黄汤对糖尿病视网膜病变模型大鼠视网膜新生血管的作用△

时倩倩 高彦 王李理 孙广莉 陈秀英 李晓鹏 崔龙江

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是常见的致盲性眼科疾病，严重危害患者的身心健康，影响患者的生存质量。有研究显示，约40%的糖尿病患者视网膜有明显的血管病变，且一旦血糖无法控制会导致视网膜持续出血，严重影响视力[1]。持续的高血糖状态会致使血-视网膜屏障受损，视网膜微血管异常增生，纤维组织增加，视网膜功能受到影响，患者视力下降[2]。临床DR治疗以羟苯磺酸钙等西药为主[3]，尽管疗效肯定，但其毒副作用及后期效果不明显等缺点不容忽视，应用中医药经典方剂进行DR防治研究具有重要的临床价值和现实意义。

杞菊地黄汤源自清朝《医级宝鉴》，主治肝肾亏虚导致的视物不清，现在临床主要用于治疗白内障、老年性黄斑变性、青光眼以及DR等多种眼部慢性疾病[4-5]。此外，杞菊地黄汤具有良好的降血压和降血糖功效[6-7]，相比于西药单一作用途径和靶点，该方在治疗DR上有其独特优势。目前，杞菊地黄汤及其成药研究主要集中在临床，涉及分子机制的基础研究不多，而其是否能够抑制视网膜血管生成尚未见报道。本研究从DR发生发展相关的视网膜新生血管着手，旨在探明杞菊地黄汤的作用途径及内在机制，为其临床推广应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物杞菊地黄汤由枸杞、菊花、熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻等药物组成，原药材均购买于北京同仁堂有限公司，全方水提2次，合并提取液，浓缩至所需体积。羟苯磺酸钙胶囊购自宁夏康亚药业公司，规格为每粒0.25 g，直接蒸馏水溶解使用。

1.2 实验动物SPF级雄性Sprague Dawley大鼠60只，体质量200～220 g，8周龄，购自上海斯莱克实验动物公司(合格证号为201801532971)。动物购入后先适应性喂养7 d，而后开始正式实验。

1.3 主要试剂与仪器STZ(美国Sigma)；血糖仪、血糖试纸(美国Johnson)；血管生成素-1(Ang-1)、血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒(南京建成)；缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)一抗(美国Cell Signaling Technology)；HRP-IgG二抗(武汉博士德)；荧光素钠注射液(广州白云山)；视网膜成像系统(加拿大Optoprobe)；光学显微镜(德国Zeiss)。

1.4 造模、分组与给药方法取50只Sprague Dawley大鼠，禁食12 h后一次性给予STZ溶液(尾静脉注射)40 mg·kg-1，72 h后检测大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol·L-1视为糖尿病模型建立成功(动物均造模成功)。挑选48只糖尿病模型大鼠按照血糖随机分为4组：模型组、羟苯磺酸钙组、杞菊地黄汤高剂量组、杞菊地黄汤低剂量组，每组12只，10只未处理大鼠为对照组。分组完成后，除对照组外，其他组大鼠均给予高脂饲料喂养4周，随机挑选4只大鼠进行眼底荧光素血管造影(FFA)检查，观察视网膜是否具有病变。而后开始给药，羟苯磺酸钙组给予等效剂量的羟苯磺酸钙溶液(5.4 mg·kg-1)，杞菊地黄汤高、低剂量组分别给予临床等效2倍、1倍剂量的复方中药(16.74 g·kg-1、8.37 g·kg-1)，每天给药1次，持续4周。给药完成后，检测所有大鼠FBG，每组各选取5只大鼠行FFA检查，麻醉大鼠，腹主动脉取血，分别取左右眼视网膜保存于液氮中备用。

1.5 FFA检查观察视网膜血管生成情况FFA检查前采用复方托吡卡胺滴眼液使大鼠充分散瞳，予以腹腔注射100 g·L-1荧光素钠溶液(1 mL·kg-1)，注射完成后观察各组大鼠右眼视网膜微血管数量及荧光素有无渗漏。

1.6 ELISA检测大鼠血清中Ang-1、VEGF含量收集各组大鼠血清后，采用ELISA试剂盒检测血清中Ang-1、VEGF的含量，根据标准曲线和吸光度(A)值计算各组大鼠血清中Ang-1和VEGF含量。

1.7 Western-blot观察各组大鼠视网膜HIF-1α、VEGFR2蛋白表达取各组大鼠视网膜组织，加入1 mL RIPA组织裂解液，充分匀浆、离心，测定总蛋白含量。Western-blot检测主要步骤：制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样，80 V恒压电泳至溴酚蓝跑出分离胶后，将蛋白转移至PVDF膜上，50 g·L-1脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别加入稀释后的兔抗大鼠多克隆一抗(11000)，4 ℃孵育过夜。第2天用TBST液洗3次，每次15 min，加入山羊抗兔单克隆二抗(1500)室温下孵育4 h，TBST液洗3次，每次15 min，化学发光法显影。应用Image J软件分析条带灰度值，根据目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值计算HIF-1α、VEGFR2的相对表达量。

1.8 RT-PCR检测大鼠视网膜Ang-1、VEGF mRNA表达充分提取视网膜组织的总RNA，核酸定量仪检测核酸含量。采用PrimeScriptTMRT试剂盒与SYBR®Premix Ex Taq试剂盒进行PCR扩增反应，以GAPDH基因为内参。引物由上海吉玛公司合成，Ang-1引物序列(206 bp):上游引物为5’-GTTAGGCCAGGAATGT-3’，下游引物为5’-CCTGGGATTCCGATTGCCA-3’；VEGF引物序列(129 bp)：上游引物为5’-GTTACGGTACCTTGAACTAC-3’，下游引物为5’-CGGCTTAATTAAGGCTTACCG-3’；GAPDH引物序列(178 bp)：上游引物为5’-GCTTACCGACTTACGGACC-3’，下游引物为5’-CCTATAGCGTTAACACTATG-3’。

1.9 统计学方法采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，多组间比较采用ANOVA分析和LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG比较对照组和模型组大鼠FBG比较，差异有统计学意义(P<0.01)；药物干预后，高剂量杞菊地黄汤能显著降低大鼠FBG(P<0.05)，低剂量杞菊地黄汤也具有一定的降血糖效果，而阳性药羟苯磺酸钙则无降血糖作用。见表1。

组别FBG/mmol·L-1Ang-1/μg·L-1VEGF/ng·L-1对照组5.41±0.086.21±0.92110.92±12.99模型组 26.41±1.21∗∗10.71±1.34∗ 149.81±15.21∗∗羟苯磺酸钙组26.19±1.427.81±0.69#121.40±10.98##杞菊地黄汤高剂量组21.80±2.41#7.29±0.90#117.75±14.09##杞菊地黄汤低剂量组23.79±2.109.13±0.15132.00±13.21

注：与对照组比较，*P<0.05、**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.01

2.2 各组大鼠视网膜血管生成情况对照组大鼠视网膜血管均匀分布，无荧光素渗漏；模型组大鼠能观察到明显的荧光素渗漏，且局部渗漏区域连接成片，眼底新生血管增多；杞菊地黄汤高剂量组和羟苯磺酸钙组视网膜荧光素渗漏面积显著减少，且基本只发生于微血管末端，微血管数量也显著下降；杞菊地黄汤低剂量组荧光素渗漏减少，但视网膜上仍有较多的新生血管。见图1。

图1 各组大鼠右眼FFA图

2.3 各组大鼠血清中Ang-1、VEGF含量与对照组比较，模型组大鼠血清中Ang-1和VEGF含量均显著升高(均为P<0.05)；与模型组比较，杞菊地黄汤高剂量组和羟苯磺酸钙组血清中Ang-1、VEGF含量均显著下降(均为P<0.05)，且杞菊地黄汤高剂量组下降更为明显。见表1。

2.4 各组大鼠视网膜中HIF-1α、VEGFR2蛋白水平与对照组比较，模型组大鼠视网膜中HIF-1α和VEGFR2蛋白表达均显著升高(均为P<0.01)；与模型组比较，杞菊地黄汤高剂量组和羟苯磺酸钙组HIF-1α、VEGFR2蛋白表达均显著下降(均为P<0.01)，杞菊地黄汤低剂量组HIF-1α蛋白表达下降(P<0.05)。见图2、表2。

图2 各组大鼠视网膜中HIF-1α、VEGFR2蛋白电泳图 A：对照组；B：模型组； C：羟苯磺酸钙组；D：杞菊地黄汤高剂量组； E：杞菊地黄汤低剂量组

组别HIF-1α蛋白VEGFR2蛋白对照组0.71±0.080.24±0.04模型组 0.95±0.12∗∗ 0.51±0.06∗∗羟苯磺酸钙组 0.75±0.08##0.32±0.05##杞菊地黄汤高剂量组 0.76±0.07##0.29±0.03##杞菊地黄汤低剂量组0.81±0.09#0.45±0.06

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.01

2.5 各组大鼠视网膜中Ang-1、VEGF mRNA表达与对照组比较，模型组大鼠视网膜中Ang-1、VEGF mRNA表达均显著升高(均为P<0.01)；与模型组比较，杞菊地黄汤高剂量组和低剂量组大鼠视网膜组织Ang-1和VEGF mRNA表达均显著下降(均为P<0.05)。见表3。

组别Ang-1 mRNAVEGF mRNA对照组1.01±0.011.00±0.00模型组 2.71±0.45∗∗ 1.97±0.26∗∗羟苯磺酸钙组 2.04±0.28##1.32±0.15##杞菊地黄汤高剂量组 1.78±0.24##1.34±0.12##杞菊地黄汤低剂量组2.25±0.24##1.62±0.20#

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05、##P<0.01

3 讨论

DR是一种常见的糖尿病微血管并发症，以微血管不断形成、视网膜渗漏水肿、严重时出血等为临床特征[8]。传统医学将视网膜病变称为“高风内障”或“视瞻昏渺”，属内障疾病，本质与肝肾亏虚相关。目为肝之窍，肝血营养于目,目得肝血而能视，肝与肾同源，肾藏精，肝藏血，肝肾精血互用，肾亏则会影响眼的形成发育与衰退。《银海精微·序》曰：“肝肾气充则精彩光明，肝肾气乏则昏矇晕眩。”杞菊地黄汤是治疗肝肾精血不足的名方，方中熟地黄益肾填精补血，枸杞补益肝肾、祛风明目，菊花清肝明目，山茱萸温补肝肾，山药补益固精血，牡丹皮清泻肝火，茯苓健脾渗湿，泽泻泄肾湿浊，全方有补有泄，共奏滋肾、养肝、明目的功效。

尽管杞菊地黄汤已在中医临床运用多年，但其基础研究并不广泛。本研究发现，杞菊地黄汤能够抑制视网膜新生血管生成，减少荧光素渗漏，保护视网膜组织，同时还具有良好的降血糖功效，与中药复方多环节多途径的作用特点相符。有研究表明，抑制视网膜新生血管的生成是DR防治的根本[9-10]。本研究所使用的阳性药羟苯磺酸钙即是一种血管保护剂，能够减轻视网膜渗出、出血，减少微血管生成。除羟苯磺酸钙外，临床常使用的抗DR药物还有胰激肽原酶和甲钴胺，但以上药物均无降血糖的相关报道。由此可见，杞菊地黄汤治疗DR有其独特优势，能够降血糖而治本，该作用与主要成分熟地黄有关。

本研究结果发现，高、低剂量的杞菊地黄汤均能有效降低DR大鼠视网膜中Ang-1和VEGF mRNA表达，显示其对该靶点有独特的调控作用。Ang-1和VEGF均是与血管生成密切相关的分泌因子，都参与内皮细胞的血管形成过程[11]。其中VEGF是已知的促血管生长作用最强的细胞因子，其表达水平与微血管形成数量呈正相关[12]。VEGF通过与其受体VEGFR2结合，诱导血管内皮细胞增生，参与新生血管形成整个过程[13]。Solà-Adell等[14]研究报道，羟苯磺酸钙能够作用于VEGF及其受体信号通路抑制视网膜微血管生成，本研究结果与该报道一致。

本研究还在明确对VEGF的重要调控作用基础上，对其上下游靶点进行研究，发现高剂量杞菊地黄汤能够抑制视网膜中HIF-1α和VEGFR2蛋白的表达。研究显示，VEGF的表达程度是受体内血管生成刺激因子和抑制因子间相对平衡状态的影响[15]。在缺氧状态下，血管生成的平衡调节被打破，VEGF分泌增加，是视网膜发生病变的重要原因[16]。HIF-1α是一种缺氧诱导因子，也是VEGF的直接上游因子，在缺氧引起的细胞应激过程中，会促使内皮细胞分泌VEGF等血管生成促进因子[17]。VEGF诱导血管内皮细胞生成的作用依赖于其受体完成，其中，VEGFR2与VEGF的结合能力最强，当前者被敲除时，内皮细胞的增殖迁移成血管能力明显受到抑制[18-19]。从HIF-1α被激活，到作用于VEGFR2受体进而促使血管生成，是动脉粥样硬化等多种心血管疾病的重要诱因，也是促进糖尿病创面愈合的关键信号[20]。基于此推测，持续的高血糖损伤血-视网膜屏障，致使内皮细胞处于缺氧状态，HIF-1α被激活，介导内皮细胞分泌VEGF等促血管因子，并作用于特异性受体而参与血管新生，视网膜功能受到影响而发生DR。杞菊地黄汤能够作用于VEGF的上下游靶点，说明其可能通过该信号发挥抑制新生血管形成的功效。

综上所述，杞菊地黄汤能够通过抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR2信号通路保护视网膜组织，减少视网膜新生血管。本研究从新生血管角度阐明了杞菊地黄汤治疗DR的作用机制，利于该方的推广应用及DR的临床防治。