电针对负透镜诱导型近视豚鼠睫状肌中表皮生长因子及其受体表达的作用△

吴姗姗 魏慧霞 郭滨 殷学伟 刘德政 郭大东 毕宏生

近视是严重危害青少年眼部健康的常见疾病之一。目前，全世界近视患病率逐年上升，患者低龄化趋势明显。近视病因复杂，调节痉挛是近视形成的病因之一，而睫状肌是引起调节反应的关键组织，其在形态学和电生理学上具有平滑肌细胞的典型特征[1]。研究发现[2]，近视患者睫状肌增厚，收缩性差，可影响近视的发展。表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是一种多功能生长因子，广泛分布于人体各组织中，而表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)存在于除脉管系统之外的各种平滑肌组织中[3]。Yamaguchi等[3]首次证明EGF作用于EGFR会对睫状肌的收缩产生直接影响。电针治疗近视已在临床上取得肯定疗效[4-5],但其机制尚未完全明确。本研究旨在探讨负透镜诱导近视豚鼠睫状肌中EGF和EGFR的表达变化，观察电针对其表达的影响，初步阐释睫状肌中EGF和EGFR的表达变化在近视发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组选取2周龄健康英国种三色短毛豚鼠90 只(济南西岭角生物科技有限公司)，体质量100～120 g，入组前对眼部进行筛查，以排除角膜病、先天性近视、白内障等眼部疾患。采用随机数字表法将豚鼠分为正常对照(normal control，NC)组、透镜诱导型近视(lens-induced myopia,LIM)组、透镜诱导型近视电针(lens-induced myopia+electroacupuncture,LIM+EA)组，每组各30只，各组均饲养2周和4周。NC组不作任何干预，LIM组、LIM+EA组豚鼠右眼均戴-6 D透镜为造模眼，左眼不戴镜作为自身对照眼；LIM+EA组在戴镜同时进行双侧太阳穴、合谷穴电针干预，每天同一时间电针干预30 min，频率 2 Hz，强度2 mA。实验过程中保持饲养温度20～25 ℃，自然照明环境下供给动物自由饮食，严格12 h/12 h 昼夜循环。

1.1.2 主要试剂与仪器10 g·L-1盐酸环喷脱酯滴眼液(美国爱尔康公司)；4 mg·mL-1盐酸奥布卡因(日本参天制药株式会社)；组织/细胞RNA快速提取试剂盒(山东思科捷科学仪器有限公司)；反转录试剂盒(含基因组去除剂)、化学修饰热启动实时荧光定量PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天生物技术有限公司)；EGF试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)；EGFR试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)； 电脑验光仪(TOPCON,日本)；眼科A超(法国Quantel Medical 公司)；荧光显微镜(日本尼康)；Elx800酶标仪(美国BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 屈光度测量各组豚鼠于造模后2周、4周处死前均进行屈光参数(近视屈光度)检查。检查前结膜囊内用10 g·L-1盐酸环喷脱酯散瞳药滴眼3 次，每次1 滴，间隔10 min，滴眼后30 min 进行屈光度检查，每眼至少测6次，取其平均值。

1.2.2 眼轴长度测量各组豚鼠于造模后2周、4周应用眼科A 超进行眼轴长度测量，测量前用4 g·L-1盐酸奥布卡因滴眼1 次，每次1滴，进行眼球表面麻醉。仪器参数设置为:前房传播速度为1557 m·s-1，玻璃体传播速度为1540 m·s-1，晶状体传播速度为1723 m·s-1[6]。测量时将探头轻触角膜并使之垂直于角膜顶点，连续测量10 次，剔除明显偏离的数值，取平均值，整个过程均由同一技师操作完成。

1.2.3 组织病理学观察豚鼠睫状肌形态各组于造模后2周、4周每组分别随机选取3只豚鼠，100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉处死，摘取各组右眼立即置于眼球固定液中固定24 h,之后进行眼球标本脱水、包埋、切片,行HE染色,观察睫状肌的病理形态变化。

1.2.4 豚鼠睫状肌中EGF、EGFR mRNA 表达水平检测造模后2周、4周，每组分别随机取6只豚鼠睫状肌组织，用组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取组织总RNA，逆转录为cDNA，采用q-PCR技术检测EGF、EGFR基因表达水平，以GAPDH为内参基因。利用DNAStar软件设计各引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，其中EGF上游引物：5’-GCTCTGGCCTCCTCATAG-3’,下游引物：5’-TGTTTTGGCCAGTCCTCTTGTTCA-3’；EGFR上游引物：5’-CTGGGCGCGGAGGAGAAGGAGTA-3’,下游引物：5’-TGGGCGGCTATCTGCATCTATCAT-3’；GAPDH上游引物：5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-3’,下游引物：5’-ATGCCAGCCCCAGCGTCAAAAGT-3’。采用2-△△Ct方法对结果进行分析，将NC组目的基因的相对表达量设置为1。

1.2.5 豚鼠睫状肌中EGF、EGFR 蛋白表达水平检测造模后2周、4周：分离各组豚鼠右眼睫状肌组织，液氮研磨，按质量体积比(20 mg200 μL)加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的放射免疫沉淀法缓冲液裂解液(radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)，充分匀浆直至裂解完全，14 000 r·min-1离心4 min，取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定蛋白浓度。按照酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒步骤检测EGF、EGFR蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组豚鼠屈光度和眼轴长度变化造模后2周、4周，LIM组造模眼(右眼)分别与自身对照眼及与NC组右眼相比，近视屈光度均增加(均为P<0.001)，眼轴均延长(2周：均为P<0.001；4周：P<0.01,P<0.001)。LIM+EA组造模眼分别与自身对照眼及与NC组右眼相比，近视屈光度均增加(均为P<0.001)，眼轴均延长(均为P<0.05)，且LIM+EA组造模眼与LIM组相比，近视屈光度均减小(均为P<0.01)，眼轴延长均减缓(均为P<0.05)，见表1。

表1 造模后2周、4周各组豚鼠屈光度和眼轴长度比较

组别屈光度/D右眼左眼眼轴长度/mm右眼左眼造模后2周 NC组2.25±0.532.02±0.428.24±0.058.23±0.07 LIM组-4.33±0.332.21±0.378.36±0.068.26±0.07 LIM+EA组-3.77±0.542.13±0.588.31±0.078.24±0.06造模后4周 NC组1.75±0.481.56±0.288.40±0.098.42±0.10 LIM组-5.96±0.461.83±0.258.55±0.078.44±0.07 LIM+EA组-2.46±0.441.69±0.368.48±0.078.43±0.06

2.2 各组豚鼠睫状肌病理组织切片观察造模后2周： NC组豚鼠睫状肌纤维完整、排列有序； LIM组睫状肌纤维断裂、溶解，排列混乱； LIM+EA组睫状肌纤维排列相对完整，排列较为有序。造模后4周：NC组豚鼠睫状肌纤维完整、排列有序，与2周NC组相比排列较为疏松；LIM组豚鼠睫状肌纤维断裂、溶解，排列混乱，与2周相比，溶解更为彻底；LIM+EA组豚鼠睫状肌纤维排列相对完整，排列较为有序，见图1。

图1 造模后2周、4周各组豚鼠睫状肌病理组织切片观察

2.3 各组豚鼠睫状肌中EGF、EGFR mRNA表达水平造模后2周、4周， LIM组右眼睫状肌中EGF mRNA、EGFR mRNA表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显降低(均为P<0.05)，而NC组和LIM+EA组EGF mRNA、EGFR mRNA表达水平相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图2、图3。

2.4 各组豚鼠睫状肌中EGF、EGFR蛋白表达造模后2周、4周， LIM组右眼睫状肌中EGF 蛋白表达水平分别与NC组和LIM+EA组相比均明显降低(P2周<0.001，P2周<0.01；P4周<0.001,P4周<0.05)，且LIM组EGFR 蛋白表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显降低(均为P2周<0.01;P4周<0.01,P4周<0.05)，而NC组和LIM+EA组EGF、EGFR蛋白表达水平相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，见图4、图5。

图2 造模后2周、4周各组豚鼠睫状肌中EGF mRNA表达水平 *：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001 图3 造模后2周、4周各组豚鼠睫状肌中EGFR mRNA表达水平 **：P<0.01，***：P<0.001 图4 造模后2周、4周各组豚鼠睫状肌中EGF 蛋白表达水平 *：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001 图5 造模后2周、4周各组豚鼠睫状肌中EGFR 蛋白表达水平 *：P<0.05，**：P<0.01

3 讨论

经典的近视诱导方法主要有形觉剥夺性近视和透镜诱导型近视两种。本实验采用负透镜诱导豚鼠制备近视模型，很好地模拟了近距离工作在人眼近视发生发展中的作用，为研究电针干预近视豚鼠睫状肌中EGF及EGFR的变化奠定了模型基础。

有研究表明[7-8]，EGF可通过影响视网膜-巩膜信号通路上的相关因子的活性促进视网膜色素上皮细胞和巩膜细胞的增殖，提示EGF的水平变化可能影响近视发展。本研究结果显示，近视豚鼠睫状肌中EGF表达水平明显下调，而电针干预后近视豚鼠睫状肌中EGF表达水平上调且近视发展有所延缓，提示电针干预近视豚鼠可影响睫状肌中EGF的表达水平并可延缓近视发展。EGF可影响平滑肌细胞的收缩[9-10]，且组织和细胞代谢水平的差异会导致EGFR表达和EGF在平滑肌细胞的结合位点不同，而代谢活跃的细胞具有高水平的EGFR表达[11]。此外，EGFR参与血管平滑肌收缩受氧化还原及氧气水平的调节[12]。由此可见，氧气含量低或代谢水平低的组织EGFR表达水平低，这与本研究结果高度一致。

本研究通过观察睫状肌中EGF及其受体EGFR的表达变化，发现二者在近视模型组均下调表达，并随近视程度加深表达量下降，而在电针干预近视模型组中二者均恢复性上调表达，且与正常对照组差异无统计学意义，提示EGF及其受体EGFR在睫状肌中的表达水平与近视的发生发展有密切关系，而电针干预治疗可以显著提高二者的表达水平，对近视的治疗有一定的作用，其可能的机制是近视过程中睫状肌收缩痉挛，导致组织缺血缺氧，代谢能力下降，随着EGF及其受体EGFR表达下降，细胞分裂增殖能力降低，数目减少，调节能力下降，最终导致近视发生；针刺眼部穴位太阳穴可以调节眼部组织血流和经络，清除代谢废物及阻塞，提升睫状肌组织的代谢能力，使EGF及EGFR表达上调。然而，睫状肌中EGF与EGFR结合后参与肌肉组织形态及功能改变的具体信号分子及其通过的具体机制尚未完全明确，仍需进一步设计实验探索其可能的分子机制，为研究近视发生发展过程中睫状肌的作用提供有效的分子生物学基础。