新型冠状病毒及其检测方法研究进展

王越珉，雷喜梅，邬 丽，伍义行，叶子弘，俞晓平

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018)

2019年12月下旬，中国武汉出现了SARS样疾病感染者。患者表现出发烧、咳嗽、乏力等症状，重症患者可出现急性呼吸衰竭综合征[1]。2020年1月11日，中国卫生健康委员会将该致病原称为新型冠状病毒(2019-nCoV)。2月11日，WHO在全球研究与创新论坛上宣布将新冠肺炎正式命名为2019冠状病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。同时，国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组也正式宣布，将2019-nCoV定名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)[2]。虽然，SARS-CoV-2较SARS和中东呼吸综合征(MERS，middle east respiratory syndrome)的病死率低(分别为9.6%和34.4%)，但该病毒传染性强、传染途径隐蔽、传播速度快。截至3月19日，我国累计确诊病例81202例，其他国家确诊病例124099例，共计死亡病例逾8000人，数字远超2003年暴发的SARS(确诊8069人，死亡774人)和2012年的MERS疫情(确诊2494人，死亡858人)[3，4]。目前，全世界166个国家或地区已发现有新冠肺炎确诊病例。该病毒在意大利、伊朗、西班牙、德国及美国等国家大范围传播，确诊患者正在大幅增加，其中意大利患者病死率已达7.9%。

COVID-19病例流行病学研究表明，我国SARS-CoV-2首次发现于武汉华南海鲜批发市场[1]。病毒可通过飞沫、直接接触或气溶胶传播，存在粪口传播风险[5]，无症状病毒携带者也可传播病毒，这极大地增加了COVID-19大流行的危险[6]。尽管过去几十年，科学家们对人冠状病毒开展了大量研究，但其特异性疫苗和有效治疗方法迄今仍在试验阶段，COVID-19的有效疫苗和治疗策略也在研发和评估中。因此，深入清晰地了解SARS-CoV-2的病原学特征，建立灵敏、特异、稳定的检测方法是现阶段做好疫情防控、病毒检测和病程监测的基础和关键。本文根据现有实验证据总结SARS-CoV-2的病原特征，并对病毒分离鉴定、核酸检测及蛋白检测等方法进行分析，以期对相关检测技术的研发和COVID-19的有效防控提供参考。

1 病毒的病原学特征

冠状病毒(coronaviruses，CoVs)是已知具有最大基因组、有包膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。目前共鉴定出SARS-CoV-2等7种可引起人类疾病的冠状病毒，其中229E、HKU1、OC43和NL63为低致病性病毒，主要引起上呼吸道感染，造成典型的温和性呼吸道症状；SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV为高致病性冠状病毒，主要感染下呼吸道，引起致死性肺炎[3]。

冠状病毒科分为冠状病毒亚科和曲状病毒亚科，其中冠状病毒亚科包含α、β和γ等3个属。几乎所有的α属、β属冠状病毒均有哺乳动物宿主，而γ属冠状病毒分离自禽类。SARS-CoV-2属于冠状病毒亚科β属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒直径约为60～140 nm，圆形或椭圆形。当前关于SARS-CoV-2的物理化学性质还不甚清楚。根据SARS-CoV和MERS-CoV的研究推测其对紫外线和热灭活较敏感。

SARS-CoV-2的基因组包括29891 nt(GenBank no.MN908947)，编码9860个氨基酸，4个结构蛋白：刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、囊膜蛋白(E蛋白)及核衣壳蛋白(N蛋白)(如图1)。分子进化分析表明，SARS-CoV-2与云南来源的蝙蝠冠状病毒高度相似(96.3%的序列相似性)，但与SARS-CoV及MERS-CoV则较远，分别约79%和50%的序列相似性[2]。研究显示，SARS-CoV-2在疫情发生过程中已产生了149个点突变，演化出L和S两个亚型，并具有显著差异的地域和人群分布比例[7]。L亚型占检测样品的70%，在武汉疫情暴发早期的样本多为L亚型。

图1 主要结构蛋白编码基因(S=刺突蛋白、E=囊膜蛋白、M=膜蛋白、N=核衣壳蛋白)和辅助蛋白ORF的位置[2]Figure 1 Location of major structural protein-encoding genes(S=Spike protein, E=Envelope protein, M=Membrane protein, N=Nucleocapsid protein) and accessory protein ORFs[2]

SARS-CoV-2包含ORF1ab、S、E、M、N等6个主要的功能性开放阅读框(open reading frame，ORF)和ORF3b、OFR8等附属基因。其中，S、M及E蛋白构成病毒囊膜，是病毒免疫反应的主要表面抗原；N蛋白位于病毒核心，与病毒RNA结合，构成核衣壳，其序列高度保守[8]。S蛋白会被宿主蛋白酶完全或部分裂解为S1和S2亚基。研究表明SARS-CoV-2的S2亚基高度保守，与SARS-CoV的S2亚基有99%的相似性。S1亚基含有2个结构域，分别是位于N端的胞内域和C端的细胞受体结合域。尽管SARS-CoV-2的S1亚基与SARS-CoV的S1亚基仅有约70%的相似性，但其同源建模显示两种病毒的受体结合域高度相似，均能通过结合广泛表达于人肺泡上皮细胞的血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)感染细胞，且SARS-CoV-2结合ACE2的能力是SARS-CoV的10倍[9]。SARS-CoV-2甚至可以在结合宿主细胞后增强ACE2的表达，进而引起严重肺泡细胞损伤。这也在一定程度上解释了，为什么SARS-CoV-2具有比SARS更强的传播能力，能够感染各个年龄阶段的人群[10]。ACE2将可能成为SARS-CoV-2诊治措施中的重要靶标。M蛋白是SARS-CoV-2中含量最高的蛋白，构成病毒的整个外部形态。E蛋白含量则最少，在种属间差异较大，但被单敲除后会影响病毒的感染。

研究表明，蝙蝠和禽类是冠状病毒繁殖与进化的理想储存宿主[11]。大部分冠状病毒新成员，包括SARS-CoV以及其它4株α属和3株β属的冠状病毒，均分离自蝙蝠。当前研究尚未明确SARS-CoV-2的宿主，但有证据显示蝙蝠可能为其自然宿主，水貂或穿山甲可能为其中间宿主。尽快明确其中间宿主将对疫情的防控有重要意义。

2 检测方法研究进展

由于新型冠状病毒隐蔽性和感染性强的特点，急需灵敏、特异和稳定的检测方法以保障病毒感染的确诊、患者治愈的判定和疫情的监测。目前SARS-CoV-2检测方法主要包括病毒分离鉴定、核酸检测和蛋白检测。

2.1 病毒分离鉴定

根据柯赫法则进行病毒分离培养与鉴定是确定新型冠状病毒感染的重要检测方法，也是后续开展SARS-CoV-2相关科研和诊疗工作的基础。通过感染细胞、实验动物等方法进行病毒分离纯化与扩增，进一步噬斑纯化得到病毒毒株后，研究人员结合电镜观察、测序分析和进化分析，判定病毒的种属及分类地位。中国疾病预防控制中心和武汉病毒研究所石正丽团队分别在2020年1月成功对新型冠状病毒进行了分离和测序。之后国内外多个团队根据SARS-CoV培养经验，利用多种细胞(如人呼吸道上皮细胞、Vero E6和Huh-7细胞系等)实现了病毒的体外培养，并进一步发现，SARS-CoV-2在感染人呼吸道上皮细胞96 h后可观察到细胞病变，但在Vero E6和Huh-7细胞感染6 d内未见细胞病变的发生[1]。

分离鉴定不同地区、不同病程的病毒株对病毒致病机制研究和疫苗生产至关重要。但SARS-CoV-2分离培养技术难度高、周期长、安全性低，需要在高级别生物安全实验室(BSL-3)进行，不适合于临床检测和病程监测。

2.2 核酸检测方法

核酸检测作为病毒临床检测中的重要方法，常成为病毒性疾病确诊的首要标准，在新冠肺炎疫情防控过程中起着重要作用。截至2020年2月27日，全球至少50家单位研发了SARS-CoV-2核酸检测技术，并获得突破性进展。全球科学家特别是中国科研工作者在本次疫情过程中付注了巨大努力，不断缩短病毒核酸检测周期，简化核酸检测流程。目前，SARS-CoV-2核酸检测方法主要包括测序技术、PCR技术和等温扩增技术。

2.2.1 核酸测序技术

利用先进测序技术解读SARS-CoV-2的遗传密码，帮助了解病毒的来源和进化，是COVID-19患者确诊的依据之一。目前已有相关的测序试剂盒被研发应用，如广州万孚生物技术股份有限公司基于半导体测序法研发的病毒全基因组靶向测序试剂盒，可在24 h内完成96人份样品检测，平均测序深度为2 000；深圳华大基因股份有限公司基于联合探针锚定聚合测序法研发的检测试剂盒，能够鉴别诊断多种呼吸道病原序列，实现病毒序列快速检测。但是测序技术存在时间长、费用高等不足，不适用于大规模筛查。因此，SARS-CoV-2测序试剂盒市场占比较低。

目前，测序技术已经发展到第四代。Nanopore技术是一种单分子实时测序技术，以单分子(DNA或RNA)通过生物纳米孔的电流变化进行碱基测序，可结合小型实时测序设备进行实时长读长测序，非常适合现场快速检测，将是未来重要的发展方向。据报道，武汉大学联合团队已于2月29日针对SARS-CoV-2和40余种呼吸道病毒开发出纳米孔靶向测序技术，实现了10 min完成高浓度样品和4 h内完成低浓度样品的多种病毒筛查，并且病毒阳性检出率较qPCR方法提高43.8%。该方法还可实现对新型冠状病毒基因组突变情况实时监测[12]。

2.2.2 PCR技术

聚合酶链式反应技术是通过扩增病毒特异性片段来检测病毒的有无。实时RT-PCR和快速多重PCR不仅具有很高灵敏性和特异性，还能区分病毒类型和亚型，适用于多种类型的病毒样品。与核酸测序技术一样，PCR技术已作为SARS-CoV-2患者确诊标准被写入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》。在检测方法研发过程中，各团队主要针对新型冠状病毒基因组中ORF1ab、N和E等基因的保守区域设计扩增引物，以避免SARS-CoV或MERS-CoV的非特异性干扰。为提高特异性，国家卫建委要求在一份样品中针对病毒的两个靶标(ORF1ab和N)进行特异性PCR检测，若Ct值均小于37，则报告为阳性，病人确诊感染。

2020年1月24日，由上海之江生物科技股份有限公司研发的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒成为首个经法定检测机构检定合格的新型冠状病毒检测产品，并在1月26日通过国家药监局审批。运用该试剂盒可在2 h左右完成一个样品的检测，有效减少患者确诊时间和成本，但是仍存在假阴性率高等问题。为提高检测灵敏度，中国计量科学研究院设计和优化相应引物、探针、阴性对照、阳性对照、内参基因，成功研发了SARS-CoV-2高灵敏数字PCR检测方法，实现病毒的绝对定量，有效缩小检测灰区、减少样品杂质影响。随着病毒的全球蔓延，世界各地也开展了对SARS-CoV-2检测技术的研发。其中日本杏林制药通过优化温度调节系统，利用毛细管基连续流动PCR微流控装置研发了微观流体基因定量检测装置GeneSoc，将检测时间缩短到15 min，可用于现场快速检测。

2.2.3 等温扩增技术

等温扩增技术结合了PCR技术灵敏、特异的优点，又不需要昂贵设备，且操作简便，肉眼即可判定结果，是适合于现场检测的快速核酸检测技术。以环介导等温扩增技术为例，该技术在具有链置换活性功能的DNA聚合酶作用下，将四条特异性引物与靶基因六个不同区域退火杂交，从而实现在等温条件下扩增核酸序列，突破了传统核酸检测技术效率不够高、昂贵、操作不便的瓶颈。

尹秀山博士团队利用逆转录环介导等温扩增技术检测ORF1ab，在65 ℃恒温条件下检测限可低至10个拷贝，灵敏性达97.6%[13]。中国疾病预防控制中心与江苏奇天基因生物科技有限公司则共同研发了新型冠状病毒核酸重组酶介导扩增技术检测试剂盒，可以在8～15 min完成样品检测。除此之外，基于恒温扩增芯片法的首个多指标SARS-CoV-2检测试剂盒于2月22日获国家药监局批准。该试剂盒能在1.5 h内对16人份样品的6种呼吸道病毒核酸进行检测，可有效鉴别2019冠状病毒病患者，帮助患者获得精准治疗。

2.3 蛋白检测方法

蛋白检测在疫情发生初期受限于病毒抗原和抗体的获得，研发速度慢于核酸检测。该方法稳定、便捷、快速，适用于大规模筛查和病程监测，主要包括病毒抗原检测和抗体检测两部分。蛋白检测方法一般利用抗原抗体特异性结合的原理，其中以竞争法为主。这种方法是将病毒抗原或特异性抗体固定于固相载体上，作为固定相，以患者体液样品作为液体相，通过液体相与固定相上抗原或特异性抗体发生相互作用进行检测。在此过程中，体液中特异性抗体或病毒抗原相对于其他蛋白质亲和力更高、结合能力更强，能与固定相上的抗原或抗体特异性结合，最后配合特定的显色方法进行样品中病毒抗原或抗体检测。

2.3.1 病毒抗原检测方法

抗原检测方法主要利用特异性抗体检测病毒主要结构蛋白，具有稳定方便、操作简单易行等特点，适用于现场筛查。被测抗原主要针对SARS-CoV-2病毒的表面结构蛋白或者高度保守的蛋白，例如N蛋白、S蛋白等。但抗原检测法受所用抗体的质量、免疫原性等影响，对病毒抗原蛋白的检测阈值有一定差异。病毒抗原检测方法除了竞争法以外，还有双抗夹心法，其原理为将捕获抗体包被于固相载体上，与含有目标抗原的待检样品进行孵育，最后以特异性的标记抗体孵育，通过特定方式显色后对结果进行分析。目前，已经有关于SARS-CoV-2双抗夹心法的报道。例如美康生物公司研发的新型冠状病毒蛋白快速检测试剂盒。该试剂盒利用固定在硝酸纤维膜检测区带上的抗体，捕获样本中的新型冠状病毒蛋白抗原，与标记在纳米颗粒上特异性抗体孵育，并运用纳米颗粒的显色作用，实现对特异性的新型冠状病毒蛋白的定性检测和快速筛查。

2.3.2 病毒抗体检测方法

病毒抗体检测方法是指利用病毒蛋白抗原为工具，检测病毒感染后诱发机体产生的特异性抗体的方法。被测抗体包括针对病毒特异性的IgG和IgM。IgM是人体接触抗原后最早产生的抗体，对于病原早期的检测有指导意义；IgG由B细胞受到SARS-CoV-2病毒抗原刺激后，分化为浆细胞产生，过程较慢。同时会有一小部分B细胞分化为记忆B细胞。当机体再次接触SARS-CoV-2病毒抗原时，记忆B细胞能迅速产生特异性IgG抗体。因此，对于早期的筛查常以IgM为检测对象，针对于后期及回顾性检测则常以IgG为检测对象。在国家卫健委第七版(诊疗方案)中，COVID-19的确诊方法已从核酸检测，扩展了针对SARS-CoV-2特异性IgM和IgG的抗体检测。

目前，已经有大量关于抗体检测方法的报道。例如，钟南山院士指导研发的基于检测血液中SARS-CoV-2 IgM抗体的胶体金免疫层析试剂盒，据介绍只需一滴血15 min就可以出结果，该试剂盒检测具有简单高效的特点，打破了现有检测对场所及人员的限制，缩短检测用时，已经与核酸检测等技术联合用于一线病毒感染的监测评估。截至3月19日，国家药品监督管理局已经审批通过8个抗体检测试剂，包括五个胶体金法抗体检测试剂、两个磁微粒化学发光法抗体检测试剂以及一个化学发光微粒子免疫检测法抗体检测试剂。

2.4 检测结果比对和量值溯源

标准样品(或标准物质)是不同实验室检测结果比对和量值溯源到国际单位的保障。新型冠状病毒核酸和蛋白标准样品(或标准物质)可用于该病毒核酸检测方法、蛋白检测方法、快速检测试剂盒质量控制与评价、实验室测量结果量值溯源，以及病毒核酸或蛋白相关研究工作。

目前SARS-CoV-2核酸检测是新冠病毒肺炎COVID-19病原学确诊的主要依据，而该病毒核酸标准样品(或标准物质)的研制及应用可以规范核酸检测试剂的质量控制和质量评价，校正实验室检测结果，减少因试剂盒质量问题等引起的检测假阴性或假阳性结果。目前，国家标准物质资源共享平台已公布GBW(E)091089新型冠状病毒核酸标准物质的研制成功，为SARS-CoV-2核酸检测标准化提供标准对照。

以公布的新型冠状病毒基因为依据，重组真核表达并纯化得到新冠病毒S、S1、N和宿主ACE2等主要蛋白，以其他国家一级生化标准物质或标样作为标准，采用同位素稀释质谱法进行定值并获得标准物质或标准样品。蛋白(抗原或抗体)检测结果常受试剂盒内有效蛋白成分的影响，结果常不稳定，其中影响检测结果可靠性及检测阈值的主要因素包括试剂盒中抗原或抗体的含量、稳定性、免疫原性等。正常情况下蛋白检测试剂盒、疫苗等从研发到临床试验再到拿证进入临床应用要3～5年，甚至更长。但这次新型冠状病毒病属于重大突发，抗原或抗体试剂盒的研制需要在短期内完成，试剂的优化、质控和灵敏度特异性测试等会有所欠缺，从而导致检测结果的不稳定。因此，需要标准样品(或标准物质)对试剂盒的检测准确度和精密度进行校准，对试剂盒生产过程进行质量控制；同样，标准样品(或标准物质)可以检测和比对病毒感染病程中不同阶段以及后续疫苗的质量评价过程中的蛋白含量。病毒相关蛋白标准样品(或标准物质)为病毒检测机构资质的认证认可提供支撑。目前，中国计量大学生命科学学院已联合浙江大学附属第四医院进行了SARS-CoV-2多个蛋白标准样品的研制和申报，建立了相应的同位素稀释质谱法等蛋白纯度定值技术，并按照标准样品制备规范进行稳定性、均匀性检测，完成不确定度评定，研发具有准确量值和溯源性的SARS-CoV-2蛋白标准样品，将有力支撑COVID-19的研究和防控工作。

3 总结和展望

COVID-19暴发以来给中国及世界公共卫生体系带来了严峻挑战。目前，疫情处于胶着状态，仍需持续强化防控和实时监测[3]。而灵敏、特异、稳定的病毒检测对疫情防控至关重要。其中病毒分离鉴定、核酸检测和蛋白(抗原抗体)检测等作为病原学检测的主要手段，三者互为补充(如表1)，共同构成了SARS-CoV-2检测技术体系。截至2020年3月19日，国家药品监督管理局共批准了SARS-CoV-2核酸检测试剂11个和抗体检测试剂8个。

表1 新型冠状病毒SARS-CoV-2检测方法的比较Table 1 Comparison of detection methods for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2

作为新发传染病从形态学上进行病原确诊的必需手段，病毒分离鉴定虽然在临床诊断的直接应用中存在局限性，但是感染综合诊断的重要依据，也是后续科学防治研究的基础。核酸检测是目前SARS-CoV-2诊断使用最广泛的方法，该方法具有特异性强和灵敏性高的特点。但根据目前国家药监局批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒来看，临床检测中常出现假阴性结果。究其原因，可能主要与下列因素有关：1)核酸检测技术本身局限性。目前批准的试剂盒基于荧光PCR法以及恒温扩增芯片法和测序法，其原理主要针对病毒特异性基因序列设计，如果病毒目标序列区段发生突变，或者PCR抑制造成模板与引物无法匹配，则可能出现假阴性结果。2)样品采集和处理问题。样品采集时间、部位和方法不同，或者样品前处理不当，可能因样品病毒载量过低导致漏检，比如临床发现部分患者咽拭子核酸检测为阴性，但其下呼吸道分泌物、肛拭子或血液标本中核酸检测则是阳性[14]。3)病毒核酸稳定性问题。SARS-CoV-2作为RNA病毒，其核酸本身较易降解，故无论样品采集、保存还是运输环节失当，均可因样品中RNA降解，造成假阴性结果。4)核酸检测质控问题。迫于疫情防控急需，目前临床核酸检测试剂盒是国家药监局按照《医疗器械应急审批程序》快速审批的，试用前尚未按体外诊断试剂报批要求完成临床试验，可能其技术和质控体系还有待完善；另外，核酸检测仪器的校准也亟需加强。

基于核酸检测的局限性，研发SARS-CoV-2蛋白(抗原和抗体)检测技术及其试剂十分必要。抗原抗体检测的关键是获得高度灵敏和特异的抗原抗体，鉴于抗体产生和消失是一个动态过程，选择合理的采样时机非常关键，由于目前对SARS-CoV-2免疫有关问题缺乏深入系统的研究，给SARS-CoV-2抗原和抗体高质量检测试剂的研发带来了困难。同时，蛋白检测本身也存在多种影响因素：1)抗原交叉反应。存在与同源性较高的同科属病毒发生交叉反应可能性，影响检测结果判断。2)血液成分干扰。血液标本中某些成分(如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等)可能干扰检测结果，存在“假阳性”可能。3)抗原抗体感染早期不易检出。由于感染早期抗原含量往往较低，而特异性抗体产生又存在窗口期，故在感染早期检出率较低。4)检测质控问题。目前尚缺乏SARS-CoV-2蛋白有证标准品，量值准确性缺乏保障。总之，鉴于抗原抗体检测的特点，其特异性和灵敏性相对于核酸检测而言有所降低，但随抗体在感染后显著升高和持续存在，蛋白检测可用于疑似病例、无症状病例检测，以及康复患者监测。更重要的是，还可通过病毒核酸、抗原和抗体联合检测，有利于缩短检测窗口期，提高检测阳性率，推动诊断前移，实现疑似患者快速诊断和密切接触人群的现场筛查，对SARS-CoV-2感染疫情防控具有重要意义。

鉴于现有SARS-CoV-2检测技术的局限性，建议今后可以加强以下三个方面的研究工作：1)蛋白标准样品(或标准物质)研发。为SARS-CoV-2蛋白的精准检测和量值溯源保驾护航。2)Sherlock检测技术研发。该技术利用等温扩增和CRISPR Cas13的“脱靶效应”，在病毒特异性CRISPR RNA的引导下，被病毒RNA激活，剪切报告基因；被剪切的报告基因将与试纸的阳性检测线结合产生信号；报告基因若未被剪切，则会与试纸的阴性检测线结合产生信号，从而给出检测结果[15]。该方法结合了蛋白检测和核酸检测技术的优点，有望为早期快速诊断提供新手段。3)完善全病程监测技术体系。鉴于目前COIVD-19尚缺乏完善的病程监测指标体系，从病毒感染和机体反应两方面，建立包括抗原、抗体、细胞炎症因子等在内的全病程监测指标体系及技术，对COIVD-19疫情防控、疾病治疗和药效评价具有重要促进作用。