毛细管电泳与核酸适配体高效筛选

朱超 赵新颖 杨歌 屈锋

摘 要 指数富集配体系统进化（SELEX）技术是核酸适配体筛选的通用技术，精准高效的筛选方法和筛选策略设计是成功筛选适配体的关键。本文概述了本课题组自2007年以来，应用毛细管电泳（CE）技术研究核酸适配体高效筛选的有关工作，包括CE在核酸适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同蛋白靶的分类及筛选策略、多种CE筛选模式和多尺度靶标的核酸适配体筛选。同时，探讨了SELEX中存在的问题，并对其发展前景进行了展望。

关键词 毛细管电泳; 核酸适配体筛选策略; 多模式筛选; 多尺度靶标;评述

1 引 言

核酸适配体（Aptamer，ssDNA[1]或RNA[2～4]）作为新型、灵活的分子识别元件，在生物学、化学、医学、 环境和食品科学以及生物信息学领域受到广泛关注[5]。它们可折叠为复杂的三维结构基序（Motif），具有配体、催化、基因调控等多种功能[6，7]。1990年，Tuerk和Gold建立的指数富集配体系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术[4]，至今仍是公认的适配体筛选方法。SELEX过程各步骤的精准高效是适配体成功筛选的关键[8，9]。目前，适配体的高效筛选仍然面临瓶颈，也制约着适配体的发展和应用。影响筛选效率有两个关键步骤：（1）复合物的形成和分离，即靶物质与核酸库序列结合形成复合物，复合物与未结合的核酸序列分离;（2）次级库的高保真制备，即通过PCR扩增复合物中的核酸序列，制备高保真的次级核酸库。

目前，普遍采用的分离方法如磁珠法、亲和微柱法都需要固体介质，难以避免由介质产生的非特异性结合，增加了筛选步骤和干扰因素[10，11]。毛细管电泳法（Capillary electrophoresis，CE）不需介质参与，靶标处于自然分子状态与核酸结合，在自由溶液中实现复合物高效分离，并且分离过程中可同时提供复合物与未结合核酸的信息[12，13]。此外，CE既可实现定性与定量分析，还可用于SELEX过程的分析评价[12]，是公认的高效筛选技术之一。目前，利用CE-SELEX技术已筛选出30余种靶标的适配体，应用结果评价较好[13]。本研究组自2007年起开展CE-SELEX方法研究以来，翻译完成了《核酸适配体手册》和《生物分析中的核酸适配体》两部专著[14，15]，连续8年撰写CE技术年度回顾[16～22]，针对适配体筛选存在的科学问题，包括适配体筛选的机理、筛选过程中的关键步骤及不同靶标筛选的特点等，进行了较深入研究，并建立了适配体高效筛选的策略和方法。本文对本研究组基于CE-SELEX的研究工作进行了概述总结，包括CE在适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同靶蛋白的分类及筛选策略、多种毛细管电泳筛选模式、 多尺度靶标的适配体筛选，结合SELEX研究进展，探讨了SELEX研究中存在的问题。

2 毛细管电泳的分析分离应用

2.1 筛选前的表征及结合条件优化

2.1.1 靶标的性质和质量表征 蛋白靶标的纯度、稳定性、保存条件、荷电性等参数的评价与表征非常必要，是有效筛选的前提。尤其是实验室制备的蛋白，筛选前进行性质表征和质量评价更为必要。利用CE，仅使用极少量的样品就可实现快速分析评价[23]，避免因样品自身问题而影响筛选结果。对完全未知的蛋白，可使用毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳准确测定其等电点（pI）和分子量，也可通过中性分子和蛋白Marker进行比较评估[24]。小分子靶标性质已知，通常样品稳定性相对较好，无需特别考虑。细胞和微生物样品[25～27]具有非均一性，且受样品培养条件和生产周期的影响，CE分析很难得到单一的峰，评价意义不大。

2.1.2 初始核酸库的影响 初始核酸库的质量是决定筛选效率的关键因素。商品化核酸库可能存在质量差异和批次差异，利用CE可以快速比较生产厂家、纯化方法、荧光标记、液固态样品和样品溶剂的影响[28]。基于初始核酸库中核酸分子的迁移速率差异建立的核酸库的分级分离方法[29]，使大容量的核酸库拆分为多个次级核酸库，提高了筛选效率。比较了不同序列长度的核酸库与不同蛋白靶标的相互作用[30，31]，结果表明，不同蛋白靶标对序列长度具有选择性，提示随意选择核酸库的长度不利于得到高效的适配体。进一步研究了初始核酸库的容量对适配体筛选效率的影响[32]。不同容量初始核酸库经两轮筛选均得到了微摩尔级的适配体，说明初始核酸库的容量对筛选效率没有显著影响。虽然高浓度的初始核酸库可能增加序列的多样性，但多样性的序列并不决定其必然的高亲和力，这也说明核酸库中序列的多样性可能并非是获得高亲和力适配体的关键，设法分离得到亲和力强的核酸序列才是成功筛选的关键。

2.1.3 筛选条件的优化 筛选过程中靶标与核酸库的孵育条件（溶液体系、pH、温度、金属离子等）直接影响复合物的形成和适配体的应用性能。目前，绝大多数报道的孵育条件都是借鉴前人经验，系统研究筛选条件的报道很少。利用CE优化筛选条件，结果直观，分离快速，耗样极少，较常规方法大大减少工作量和研究成本[12，13]。杨歌等[31]以脱铁转铁蛋白为模式蛋白进行研究，发现缓冲液种類和pH值以及孵育温度均影响靶蛋白与核酸复合物的形成。加入低浓度的金属离子（如K+、Ca2+、Mg2+）可促进复合物形成。因不同靶标的性质和结构不同，筛选前针对特定靶标需要确定优化的孵育条件。

2.2 筛选中的次级核酸库分析

2.2.1 次级核酸库亲和力分析 SELEX过程中，每轮产生的次级核酸库与靶标亲和力的提升是决定继续或终止筛选的依据。对每轮筛选得到的次级核酸库，应分析其与靶标的亲和力，利用平衡混合物的非平衡毛细管电泳（NECEEM）[33]或非线性拟合方法[34]测定平衡解离常数（KD）。如KD值持续降低，则继续筛选。如KD值变化不明显或升高，可终止筛选，减少不必要的筛选过程。例如，杨歌等[30]在筛选IgG的Fc片段适配体过程中发现，二级库、三级库的KD值持续降低，四级库则与三级库的KD值相当，降低不明显，故终止筛选，从三级库中选择候选序列。

2.2.2 次级核酸库质量评价 PCR过程中因碱基的偏向扩增、错配、突变等因素产生的副产物[35，36]不可避免。另外，实验过程中的操作污染、试剂污染、气溶胶污染也会导致PCR结果的不准确。因此，对次级核酸库的质量评价非常必要，是继续筛选的前提。利用毛细管区带电泳表征各轮次级库时发现，四级库的核酸主峰右侧出现了清晰的杂峰[37]，说明筛选过程中四级库已含有非目标核酸，核酸库质量已受到影响。筛选过程仅需使用极少量的核酸样品，即可实现高分辨率、快速的次级库质量评价。

2.3 筛选后的适配体亲和力测定 目前，文献报道了多种测定适配体亲和力的方法，包括表面等离子共振法、膜干涉法、等温量热滴定法、微量热泳动法、紫外光谱和荧光光谱法等，但不同方法间测定KD值的评价标准还未建立，主要因为这些方法原理不同、测定条件不同，导致测定的KD难以相互比较[38，39]，甚至有数量级的差异。CE是一种非平衡结合过程，测得的KD通常比其它方法大，但并不意味实际的亲和力更弱[40]。即使同是利用基于毛细管电泳的非线性拟合与NECEEM方法，其结果也有差异[37]。另外，采用NECEEM方法时，浓度比、分离温度等实验条件均影响峰面积和KD值。通过基于积分偏差的方法[41]对NECEEM计算KD值时的误差进行分析，结果表明，当峰面积在10%的偏差区间内，KD值的最大相对偏差小于7%，故条件引起的峰面积误差可忽略。

3 不同蛋白靶标的筛选策略

CE具有在线可视化的优势，通过直观地观察复合物峰和核酸库峰可快速评估蛋白靶与初始核酸库的结合强弱，并可测定KD值。根据CE特征电泳图，可将蛋白靶标归属为高、中、低亲和力三类，建立不同靶蛋白的筛选策略[42]。高亲和力蛋白的电泳图中可见明显的蛋白-核酸复合物峰，并使核酸库峰面积降低达50%以上，初始KD<50 μmol/L。这说明高亲和力类蛋白对核酸序列的选择性不高，应重点考虑特异性筛选。中亲和力蛋白的电泳图可见，小的复合物峰及复合物解离区，核酸库峰面积降低约30%，初始KD<1 mmol/L，对其亲和力和特异性筛选应处于同等考虑。低亲和力蛋白的电泳图中难以看到复合物峰和解离区，且核酸库的峰面积降低小于10%，初始KD>1 mmol/L，说明核酸库中有极少量的序列与蛋白结合。低亲和力蛋白与核酸的复合物难以形成，需优化筛选条件，或者使用修饰的核酸库，提升蛋白对核酸库的亲和力，才能获得较高亲和力的适配体。

本研究组评价了40种靶蛋白与初始核酸库结合的电泳图谱特征、KD值、逐轮筛选时序列的亲和力和特异性进化效率，并逐一分析了已报道的20多种靶蛋白的CE-SELEX筛选过程，发现这些蛋白及筛选方法都符合本研究组提出的蛋白靶分类模型和筛选策略。此外，由于碱性蛋白在毛细管壁存在吸附，筛选时要采用抑制吸附的分离方法[43，44]。利用CE分析蛋白与核酸库的亲和力，根据特征图谱，可针对不同蛋白采取不同的筛选策略和筛选方案，避免盲目筛选，显著提高筛选效率。

4 多功能毛细管电泳筛选模式

2004年，Bowser课题组首次利用CE-SELEX筛选适配体[34]，至今约有10种改进的筛选方法，如低pH CE 筛选（Low-pH-CE-SELEX[44]）、 一步在线反应CE筛选（Single step CE-SELEX，ssCE-SELEX[37]）、 同步竞争CE筛选（Synchronized competition CE-SELEX，scCE-SELEX[45]）、 平衡混合物的非平衡毛细管电泳（Non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，NECEEM[33]）、平衡混合物的平衡毛细管电泳（Equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，ECEEM[46]）、Non-SELEX[47]、 理想分离CE筛选（Ideal filter capillary electrophoresis，IFCE[48]）、 片段式收集CE筛选（Fraction collection CE-SELEX，FCE-SELEX[49]）、 高分子聚合物辅助的毛细管瞬时等速电泳筛选（Polymer-enhanced capillary transient isotachophoresis，PectI-SELEX[50]）的研究进展。2019年，本研究组[13]系统总结了CE-SELEX，并结合本研究组的研究经验，对CE筛选适配体的各技术环节进行了详细介绍。基于筛选中的问题导向，本研究组建立了3种新筛选模式。

4.1 Low-pH-CE-SELEX模式[44]

实现了靶蛋白-核酸复合物与核酸的反向迁移和完全分离，使复合物收集更准确方便。低pH条件下抑制了电渗流，克服碱性蛋白吸附，可增加进样时间，增大進样体积。

4.2 ssCE-SELEX模式[37，51]

一步电泳完成靶蛋白与核酸库的混合、孵育、柱上反应、分离、检测、收集，实现一步柱上反应筛选。该模式中，仅通过改变蛋白和核酸进样时间，即可调控反应摩尔比。控制电压可实现在线孵育。筛选仅消耗几十纳升样品，适合贵重、稀有、难制备蛋白的适配体筛选。

4.3 scCE-SELEX模式[45]

实现双靶蛋白的同时筛选和竞争筛选。基于CE的高分辨分离，一次电泳可收集两种复合物，一步筛选可得到两种蛋白的高亲和力和高特异性适配体，大大提高了筛选效率。并且，两种蛋白共存，互为反筛靶，明显降低了非特异性结合，提高了适配体的亲和力和特异性。

上述模式的建立和应用充分体现了CE的多功能和实用性，可实现高效、快速的适配体筛选。

5 多尺度靶标的核酸适配体筛选

核酸适配体的靶标范围涵盖小分子[52]、蛋白[53，54]、细胞[55]和微生物[56]等多种目标物。研究结果和实践经验表明，CE-SELEX可用于各种靶标的适配体筛选，特别是在蛋白靶标的适配体筛选方面具有明显的优势。目前，本研究组已经进行了从小分子、蛋白质到细胞和微生物的适配体筛选研究。

5.1 蛋白质

利用多功能毛细管电泳筛选模式，筛选了脱铁转铁蛋白[31]、人凝血酶[37]、牛乳铁蛋白[57]、钙网蛋白[58]、Ig G（Fc片段）[30]、NSE[32]、spyCas9、Rec A、OGG1和PDGF-BB等十余种蛋白的核酸适配体。在2020年的新冠疫情期间，本研究组在14天内快速筛选了新冠病毒结合蛋白Spike及ACE2的适配体，拟用于阻断Spike蛋白与其受体ACE2的结合。此外，还建立了研究蛋白与其它小分子、肽核酸、蛋白相互作用的多模式毛细管电泳方法[59～65]，以及一些灵敏的检测方法[66～70]，为适配体筛选前的表征和检测应用提供指导。

5.2 小分子

与核酸形成的复合物的遷移速率与核酸自身的迁移速率差距很小，难以直接分离得到复合物，前述的筛选模式都不适合。但有些小分子可以通过收集核酸库峰前面的一段区域（电泳图中不可见的解离区）进行筛选。据此方法筛选了盐酸克伦特罗的适配体[40]。此外，本研究组还设计了针对对映体分子分离的双区段串联填充毛细管电泳（ppPF-CE）模式，为手性分子的适配体筛选奠定了基础[71]。

5.3 细胞和微生物

针对全细胞的适配体筛选，建立了3种细胞（U251、Hela、PC3）与核酸库结合的评价方法。3种细胞与核酸库形成的复合物峰有明显区别，收集复合物区域可进行后续筛选[72]。针对微生物的适配体筛选，以大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和嗜酸乳杆菌（革兰氏阳性菌）为模式细菌，建立了毛细管区带电泳和毛细管亲和电泳表征和评价方法。由于细菌与核酸库的结合较弱，难以判断复合物峰，也可以采用小分子的筛选方法。细菌去壁后的原生质体与核酸库的结合显著增强，类似于全细胞，可采用全细胞的筛选方法[73]。

6 总 结

自2004年CE-SELEX用于适配体筛选以来，已展示了其所需样品和试剂量少、实验结果可视化和成本低等明显的优势。本研究组经过十余年CE-SELEX的研究积累，建立了一系列CE方法，实现了适配体筛选的高效快速分离、相互作用分析、结合条件优化和筛选过程的监测，解决了同步正负筛选、多靶筛选等问题，克服了其它筛选方法的不足。结合目前适配体筛选的研究进展[8，74～76]以及本研究组的实践经验，SELEX技术还存在一些共性问题，如无标准化的筛选程序和方法，难以控制次级库制备和测序中PCR扩增的偏性，缺少对高通量测序产生的海量数据进行有效分析和选择的法则，也缺少适配体亲和力的一致性评价方法，以及如何实现在适配体实际应用环境下的高效筛选和适配体的修饰和功能提升等，这也是本研究组未来SELEX研究的方向。

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