基于醇溶蛋白的木兰科植物鉴定技术研究

叶珊珊　王楠　高艳芳　唐密　刘梦龄　肖强

摘要：木兰科（Magnoliaceae）植物分布范围广且属种多样，属种之间形态结构差异存在许多过渡类型，在属与种之间的鉴定上存在很多争议。目前，对于木兰科植物种子分类和鉴定研究中，通常以植物学形状特征作为鉴定方法。为了探索对木兰科植物种子进行鉴别的有效途径，采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳对10种木兰科植物种子醇溶蛋白进行分析。结果发现，10种木兰科植物共分离出61条谱带，条带数大多在6～7，最多为9条，最少的6条。利用Quantityone软件对电泳谱带进行分析，发现不同种之间谱带都存在差异性，可以通过种子醇溶蛋白谱带进行木兰科植物物种鉴别。

关键词：木兰科（Magnoliaceae）;醇溶蛋白;聚丙烯酰胺凝胶电泳

中圖分类号：Q94         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）02-0098-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.020           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the identification of Magnoliaceae plants based on the alcohol-soluble protein

YE Shan-shana，WANG Nana，GAO Yan-fangb，TANG Mia，LIU Meng-linga，XIAO Qianga

（a.Hubei key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization;

b.School of Forestry and Horticulture，Hubei Minzu University，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The Magnoliaceae plants are widely distributed and varied in genus and species. There are many controversies in the identification of genus and species because many transitional types were found among different genus and species. At present， botanical shape characteristics are usually used as identification methods for the classification and identification of magnoliaceae plants. In order to further identify the magnolia plants， the acid polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the gliadin of magnolia plants. The results showed that 61 bands were separated from 10 species of magnolia，and most of the bands were between 6 and 7， with a maximum of 9， and the lowest 6. Using Quantityone software to analyze electrophoresis bands， it is found that there are differences between different bands， and species identification can be carried out through spectral bands.

Key words： Magnoliaceae; gliadin; polyacrylamide gel electrophoresis

木兰科（Magnoliaceae）是被子植物系统发育过程中较原始的科，多为常绿性，是集绿化、观赏、材用、药用、科研等多种功能于一体的优良树种[1，2]。木兰科植物分类在植物学界长期以来存在较多争论;在分类学研究中，一般采用的方法有形态学、解剖学、孢粉学、细胞学、胚胎学、植物化学、分子生物学、遗传学等，而形态学研究是系统分类学研究的主要内容。在形态学研究中，一般通过观察木兰科植物的外在特征进行鉴别，并对其茎、叶、花、果实、种子等器官进行详细的形态解剖[2]。木兰科植物种子外形极其相似，其种子的种皮分3层，外种皮是颜色鲜艳的革质层，中种皮是油质的肉质层，最内一层是坚硬、骨质的内种皮[3];其红色假种皮富含油细胞，当洗去红色假种皮后，常常会在坚硬的骨质内种皮表面发现一层油脂[4]。徐凤霞等[5]在解剖镜下观察了10属52种木兰科植物种子内种皮合点区形态，发现可分为孔型和管型两大类型，并将其运用到木兰科植物属种的分类上[2];由于存在多种不同种类木兰科植物种子合点区形态相似的情形，因此，采用这种方式鉴定所需时间较长，对鉴定者要求较高。探索一种在园林育种中对木兰科植物种子进行有效鉴定的可靠方法具有重要的实践价值。

醇溶蛋白是种子的一类贮藏蛋白，一般不受种植环境的影响，而与其遗传特性有关，既可用来区分具有遗传差异的品种（品系），又能反映出品种（品系）间的亲缘关系，通过醇溶蛋白来进行不同种类植物鉴别得到广泛应用。国内外许多研究学者采用醇溶蛋白电泳方法对大米[6]、燕麦[7，8]、荞麦[8]、意大利小米[9]、日本稗子[10]等进行了鉴别研究，取得了较好效果。但将此方法用于木本植物种属鉴别研究的报道较少[11，12]，鉴于通过形态学方法鉴别木兰科植物存在困难，本研究尝试利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析木兰科植物种子醇溶蛋白特征谱带，以达到鉴别木兰科不同种类植物的目的。

1  材料与方法

1.1  材料

成熟晾干的木兰科木兰属、玉兰属、木莲属、含笑属植物种子，由恩施冬升植物开发有限责任公司提供。各供试材料名称具体见表1。

1.2  试验方法

将供试种子去种皮，称取0.2 g，加入1.2 mL的样品提取缓冲液（含25% 2-氯乙醇、12%尿素和1% 2-巯基乙醇）。充分研磨，转入2 mL的离心管，振荡10 min，然后在12 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液。在上清液中加入等量的40%蔗糖溶液和适量1%的甲基绿溶液，振荡混匀，在12 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液，即为电泳上样液，4 ℃冰箱保存待用。

参照Bushuk等[13]的方法进行乳酸铝酸性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，并稍加修改。醇溶蛋白固定、染色、脱色参照孙克江等[14]的方法，将剥离的凝胶浸入固定液中，室温下固定0.5 h，倒掉固定液，随后加入考马斯亮蓝染色液染色2 h，取出凝胶，用去离子水洗去凝胶表面附着的染料，脱色液漂洗数次，直至谱带背景清晰。采用GEI mage scanner III图像扫描系统中反射稿模式快速扫描染色后的凝胶，记录蛋白谱带。采用Quantity one软件测定酶谱带的相对迁移率（Relative mobilities，Rf）。采用指纹图谱分析软件Cross Checker对10种木兰科植物种子醇溶蛋白电泳图进行统计;在Rf值相同的位置，如果有醇溶蛋白谱带，则记为1，无酶谱带记为0，建立0和1的二元数据矩阵。Rf=蛋白质谱带迁移距离/前沿指示剂迁移距离。

2  结果与分析

2.1  木兰科植物醇溶蛋白谱型分析

采用乳酸铝酸性电泳对10种木兰科植物种子中醇溶蛋白进行分离，发现不同种间醇溶蛋白谱型均有明显差异（图1）。10种木兰科种子蛋白谱带基本上呈現出泳道中部染色强度较上、下部大的特点， 表明这10种木兰科植物具有相似的遗传基础。蛋白谱表型经Quantity one软件分析表明，10种木兰科植物种子醇溶蛋白谱带的类型共计61种，各木兰科植物平均谱带数在6～7条，其中木莲属毛果木莲条带数最多，有9条。

2.2  木兰科植物醇溶蛋白谱亲缘分析

为进一步了解10种木兰科植物间的亲缘关系，以Nei氏遗传距离（表2）为基础数据进行分析，发现馨香玉兰和大叶玉兰亲缘关系最近，遗传距离为0.38;大叶玉兰和毛果木莲亲缘关系最远，其遗传距离可达0.53。

3  小结与讨论

醇溶蛋白电泳方法具有简单快速、重复性好、准确可靠、低成本等特点，目前国内外广泛应用于品种鉴定，可作为首选检验方法，满足种子检验数量大、品种多的需求[15]。20世纪80年代就已经利用醇溶蛋白对水稻品种进行鉴定[16];1989年中国更是把利用醇溶蛋白鉴定小麦和大麦种子的方法作为一种标准程序[17]。醇溶蛋白在植物品种的鉴定上具有重要价值。

木兰科植物鉴定的方法多样，可以通过采集样本与已有标本进行比对，还可以研究种子差异或利用分子生物学方法对木兰科植物进行鉴定。1996年，徐凤霞等[5]提出利用木兰科种子的内种皮在合点区的特殊结构来鉴别木兰科种子。2005年，夏国华等[1]提出利用观察种子形态的方法鉴别木兰科不同属的种子，并整理出种子形态特征分属检索表。2013年，李剑等[18]利用ISSR和AFLP两种分子标记方法对木兰科植物进行研究，发现木兰属和含笑属聚类在一起，其差异可以用分子标记鉴定出来。2017年，薛晓明等[19]利用电镜扫描的方法对木兰科7种植物花粉进行研究，通过花粉形态上的差异对木兰科植物进行鉴定。在木兰科植物鉴定上，植物形态学鉴定难以用肉眼分辨，难度较大。而分子标记虽然结果较精确，但成本和试验条件要求较高，无法广泛推广使用。种子贮藏蛋白的组成由遗传物质决定，不受环境影响，其组成的差异可以反映基因型的不同，一个品种通常只有一种蛋白质的电泳图谱[13，14]。因此，利用醇溶蛋白电泳技术对木兰科植物种子进行鉴定是可行的。

醇溶蛋白的提取技术极其重要，它将影响整个电泳过程的成功与否。醇溶蛋白属于一类贮存蛋白，存在于谷物的淀粉胚乳层中，具有特殊的溶解性质。它不溶于充分稀释的盐溶液，可由乙醇-水混合溶液进行提取，但有些蛋白质在这种条件下是不能溶解的。主要是因为醇溶蛋白间或其他蛋白质之间存在共价连接。所以为了提取成功还要加某些还原性试剂来破坏这些共价键[20]。对于醇溶蛋白的提取前人做了许多研究，例如在小麦醇溶蛋白提取方面，颜启传等[17]提取小麦中的醇溶蛋白时使用甲基绿粉剂和2-氯乙醇进行提取，采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分离;邵锦震等[21]利用由2-氯乙醇和2-巯基乙醇组成的复合提取剂取得了较好的提取效果。在高粱醇溶蛋白提取方面，王伟等[22]研究表明，根据蛋白浓度测定和二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，还原剂二硫苏糖醇（DDT）浓度为4%的60%叔丁醇溶液，样品质量比提取剂用量为1∶8（g/mL）是提取高粱种子醇溶蛋白的最佳条件。对油松种子中醇溶蛋白提取及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）分析表明，由1% 2-巯基乙醇和12%尿素组成的复合提取剂提取效果最佳，其次是由20% 2-氯乙醇、1% 2-巯基乙醇和12%尿素组成的复合提取剂[11]。

在木兰科植物种子中醇溶蛋白提取中，笔者采用了多种方法提取，其中效果最佳的是由25% 2-氯乙醇、1% 2-巯基乙醇和12%尿素组成的复合提取液。在聚丙烯酰胺凝胶电泳方法上，先后采用SDS-PAGE和A-PAGE电泳技术，经过多次试验，A-PAGE方案效果最佳，图谱中条带丰富，带型清晰度高。本研究建立的A-PAGE分析木兰科植物种子中醇溶蛋白质方法具有快速、准确、灵敏等优势，在鉴别木兰科不同种植物种子方面具有较高可行性。但由于收集到的品种有限，尚需进一步研究该方法对更多木兰科种子的适用性，以建立木兰科植物种子醇溶蛋白指纹图谱，为园林育种工作提供快速有效的指导。此外，利用该方法对木兰科植物系统进化研究，也是值得进一步尝试的领域。

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收稿日期：2019-04-20

基金项目：国家自然科学基金项目（31260057;31460203）;湖北省大学生创新创业训练计划项目（201710517038;201810517051）

作者简介：叶珊珊（1997-），女，广西桂林人，在读本科生，研究方向为植物生物化学与分子生物学，（电话）16677160687（电子信箱）

1271271042@qq.com;通信作者，肖  强，男，教授，主要从事植物生物化学与分子生物学研究，（电子信箱）275975926@qq.com。