人血浆中氯吡格雷及羧酸氯吡格雷浓度检测的意义

袁孔现 詹三华 范洁 王秀

氯吡格雷(Clopidogrel)为噻吩并吡啶类抗血小板药，用于血栓栓塞性疾病的治疗，临床作为急性冠状动脉综合征(ACS)患者经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的药物控制基础，防止手术期间出现血小板功能异常、血栓性闭塞情况。氯吡格雷主要通过抑制ADP介导的血小板聚集反应发挥作用。在临床PCI术中推荐使用氯吡格雷与阿司匹林相配合的表现效果较好且患者耐受性好[1]。氯吡格雷口服后吸收快速但不完全，吸收率>50%。氯吡格雷吸收后广泛经肝脏代谢，其中约85%经酯酶水解为羧酸氯吡格雷，约15%代谢为具有抑制血小板作用的活性代谢物。氯吡格雷与羧酸氯吡格雷可使用合适方法进行相关检测[2-4]。氯吡格雷常见不良反应有胃肠道损害、中性粒细胞减少，腹痛等，偶有血小板减少性紫癜，极少有致死及血恶液质反应。本文希望通过检测血液中氯吡格雷，特别是羧酸氯吡格雷浓度，对氯吡格雷不良反应发生作一相关性推断，为临床合理用药提供依据，减少药物不良反应的发生。

1 材料与方法

1.1 标准品与试剂 氯吡格雷化学对照品(Clopidogrel,European Pharmacopoeia Reference Standard,ID:001C8D)， 羧酸氯吡格雷化学对照品(Clopidogrel Carboxylic Acid,Vaughan Ontario L4K 4C7 Canada,Lot:1427-057A5),艾司唑仑化学对照品(Estazolam，国家麻醉品实验室，1218-9802)。甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚均为色谱纯(美国TEDIA公司)，KH2PO4和H3PO4为分析纯试剂，水为0.45 μm微孔滤膜过滤注射用水。空白血浆由本院血库提供的健康献血者血浆。

1.2 仪器 日本岛津高效液相色谱仪，包括LC-20AD四元泵、DGU-20A5在线脱气机、SPD-20AV紫外检测器、CTO-20A可调柱温恒温箱及LC solution色谱工作站。万分之一电光分析天平(上海天平仪器厂)、800D电动离心机(常州医科诺仪器有限公司)、MDF-382E超低温冰箱(日本三洋电机生物医学有限公司)、电热恒温水浴锅(上海跃进医疗仪器厂)。

1.3 标准溶液配制 精密称取氯吡格雷化学对照品1.10 mg，用甲醇定容至50.0 ml，配制成含氯吡格雷22.0 mg/L的对照品贮备液。精密称取羧酸氯吡格雷化学对照品1.20 mg，用甲醇定容至50.0 ml，配制成含羧酸氯吡格雷24.0 mg/L的对照品贮备液。精密称取艾司唑仑化学对照品2.50 mg，用甲醇定容至25.0 ml，配制成含艾司唑仑100.0 mg/L的内标溶液。

1.4 样品预处理 服用氯吡格雷一周的患者空腹血浆500 μl加至15 ml具塞锥底玻璃离心管中，精密加入内标溶液10 μl，涡旋振摇30 s，加入甲基叔丁基醚5 ml，密塞，涡旋振摇3 min。于离心机中以4 000 r/min转速离心4 min，静置后移取上清液至10 ml玻璃管中，于恒温水浴锅中65℃水浴，于N2流中吹干。进样前加50 μl流动相快速振摇数秒溶解样品，吸取20 μl进样。

1.5 色谱分析条件 色谱柱采用KromasilTM 100A C18色谱柱(150 mmlD×4.6 mmID,5 μm)，流动相为10 mmol/L KH2PO4溶液(含0.25% H3PO4)∶乙腈(50 ∶50)，流速为1.0 ml/min，检测波长为220 nm，柱温40℃。

1.6 方法专属性 分别取标准溶液、空白血浆、空白血浆+标准品、样品血浆经预处理后进样检测，发现羧酸氯吡格雷保留时间为1.8 min、艾司唑仑保留时间为4.2 min、氯吡格雷保留时间为7.4 min，基本无杂质峰干扰。实验显示样本中羧酸氯吡格雷、艾司唑仑、氯吡格雷能得到完全分离且与各化学对照品保留时间一致，在此实验条件下所测得结果可以代表原药浓度。见图1。

ABCD

图1氯吡格雷和羧酸氯吡格雷HPLC色谱图；A 标准品色谱，B 空白血浆色谱，C 空白血浆+标准品色谱，D 样本血浆色谱;峰1羧酸氯格雷；峰2 氯吡格雷；峰3 内标

2 结果

2.1 线性关系 取锥底试管15 ml×18支，10 ml×19支。在15 ml试管中分别加入等量内标溶液、不同量标准品溶液，再加入空白血浆500 μl混匀，配制成含羧酸氯吡格雷+氯吡格雷浓度分别为(0.12±0.11)、(0.24±0.22)、(0.48±0.44)、(0.96±0.88)、(1.92±1.76)、(3.84±3.52)mg/L的标准浓度溶液，每式3份。按“1.4”项样品预处理方法操作，取20 μl进样，计算各物质与内标物峰面积比值，参照标准溶液峰面积比值计算各物质浓度。以理论浓度值(X)与实测浓度值(Y)作线性回归，得到氯吡格雷线性范围为0.11～3.52 mg/L，回归方程为Y=1.0725X-0.037(r=0.9994)；羧酸氯吡格雷线性范围0.12～3.84 mg/L，回归方程为Y=1.0198X-0.0502(r=0.9984)。取对照品溶液吹干溶剂，经流动相稀释后进样检测，按信噪比大于5的要求，最低检测限羧酸氯吡格雷为0.06 mg/L、氯吡格雷为0.055 mg/L。

2.2 回收率 按“1.4”项样品预处理方法操作，记录氯吡格雷、羧酸氯吡格雷与艾司唑仑峰面积比值，与标准浓度对照品直接进样的峰面积比值对比，计算实测浓度和提取回收率，氯吡格雷与羧酸氯吡格雷各浓度提取回收率均在85%以上，方法符合生物样本检测要求。见表1。

表1 氯吡格雷、羧酸氯吡格雷提取相对回收率 n=3

2.3 精密度 取空试管分别加入不同量化学对照品溶液和同剂量内标溶液，并加入0.5 ml空白血浆，使血浆中氯吡格雷浓度分别为0.11、0.55、2.75 mg/L，羧酸氯吡格雷浓度分别为0.12、0.60、3.00 mg/L。按“1.4”项样品预处理方法操作，计算日内变异和5 d内日间变异，由结果可知，低、中、高三浓度日内及日间RSD均<15%。见表2。

表2 氯吡格雷、羧酸氯吡格雷精密度试验 n=5

2.4 患者血样监测 取在院的ACS患者预行PCI术前药物准备，即一次性顿服300 mg后4 h采取患者静脉抗凝血3 ml，按“1.4”项样品预处理方法操作，记录进样后的色谱图，计算患者血液中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷浓度。见表3。

表3 患者血液样本中氯吡格雷、羧酸氯吡格雷浓度监测

3 讨论

3.1 实验方法优化 本实验建立了血浆中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷的RP-HPLC检测方法，氯吡格雷保留时间7.4 min，线性范围0.11～3.52 mg/L；羧酸氯吡格雷保留时间1.8 min，线性范围0.12～3.84 mg/L。两者提取回收率均>85%，日内、日间RSD<15%，符合生物样品分析要求，可用于临床药物治疗监测。

加样回收实验中，通过对比，发现甲基叔丁基醚提取效果与正戊烷和乙酸乙酯[3]相当，带入干扰杂质较少，实验满意度较好。基本保证了实验的成功并保证了色谱柱的安全使用。

对流动相的选择与优化，本研究比较了不同系统和成分比例的的流动相对实验结果的影响[5]，最终确定使用10 mmol/L KH2PO4/H2O(水相)—CH3CN(有机相)按50∶50混合的流动相。流动相中水相和有机相分别配制和装瓶，并经超声脱气，用前经四元泵按比例抽取混和。水相与有机相以合适比例混合可以保证仪器的正常运行，不产生过高的柱压，并优化峰形，减少拖尾。水相中用H3PO4调节酸度，实验中发现H3PO4用量对实验产生较大影响。合适的H3PO4含量可以优化实验结果，使氯吡格雷保留时间缩短，同时又稍许延长羧酸氯吡格雷保留时间，降低杂质干扰。

检测波长选择220 nm，是根据氯吡格雷和羧酸氯吡格雷吸收波长扫描结果，发现两者在190～225 nm波段存在吸收，经比较选择220 nm波长作为检测波长，在此波长处两者和艾司唑仑均有较好吸收，能保证检测结果。

3.2 氯吡格雷药理作用 氯吡格雷为噻吩并吡啶类衍生物，本身为并无活性的前体药物。原药经吸收后85%通过酯酶水解为羧酸氯吡格雷，15%在肝脏细胞色素P450酶系统作用下代谢为具有抑制血小板作用的活性代谢物[6]。由于CYP2C19基因多态性的原因，氯吡格雷治疗后的临床疗效存在明显的个体差异，患者在应用常规剂量氯比格雷后血小板功能不能得到有效抑制，从而发生急性或亚急性临床缺血事件，称为氯吡格雷治疗相关的血小板高反应性(HTPR)[7]或氯吡格雷抵抗(CR)[8]，是冠状动脉PCI术后血栓事件和脑卒中再发的主要危险因素。

羧酸氯吡格雷无抑制血小板作用，但是具有胃肠道损害作用，是使用氯吡格雷引起胃肠道不良反应的主要原因，尤其是当增加氯吡格雷用药剂量以图避免氯吡格雷抵抗时更易出现胃肠道损害[9]。

3.3 氯吡格雷和羧酸氯吡格雷监测的意义 氯吡格雷作为原药，经消化道吸收后迅速代谢转化。氯吡格雷原药在血液中浓度极低[10]，使用RP-HPLC紫外检测器检测氯吡格雷血浆药物浓度较为困难，且该药物为前体药物[11]，浓度监测意义不明显；氯吡格雷硫醇衍生物与血小板ADP受体不可逆性结合，血浆半衰期仅30 min，分离提取困难，也无法检测血液中浓度[12]。硫醇衍生物药理作用效果可通过血小板功能检测来确定[13]；通过测定血栓弹力图也可以在一定程度上评价大动脉粥样硬化患者的血小板反应性，并且可以在一定程度上预测脑梗死的复发风险[14]。

服用氯吡格雷的患者，羧酸氯吡格雷在血液循环中具有较高浓度，羧酸氯吡格雷半衰期约为7～8 h[15]，可通过实验方法进行检测，且血浆羧酸氯吡格雷最大浓度及AUC与服用剂量成线性关系[16]。本文希望通过监测血浆中羧酸氯吡格雷浓度与胃肠道损害反应之间建立相关性联系，当血浆中羧酸氯吡格雷稳态浓度高于安全值时及时向临床发出警示，避免出现胃肠道损害，保证氯吡格雷安全、合理使用。

氯吡格雷具有抑制血小板聚集的作用，由于CYP2C19基因多态性的原因，其治疗效果存在较大个体差异。部分患者在应用氯吡格雷治疗时存在所谓的氯吡格雷抵抗(CR)，在正常剂量使用时存在较大的心血管不良事件发生风险，而在加大使用剂量降低心血管不良事件发生风险时却又可能使出血事件发生概率增大[17]。临床应加强对使用氯吡格雷患者的监测，以减少其心血管不良事件发生风险、降低出血事件发生概率。本研究通过实验方法学考察，建立了使用高效液相色谱法检测血浆中氯吡格雷和氯吡格雷羧酸的实验方法。该实验方法可快速、简便地检测服用氯吡格雷的患者血浆中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷两种物质的浓度，为保障患者用药安全，减少药物不良反应的发生提供有关治疗药物监测的药学服务。