血同型半胱氨酸、高迁移率族蛋白B1与冠心病发生及严重程度的相关性研究

朱小山，马可忠，周汉云，杨 峰，刘建飞

冠心病是中国乃至全球面临的一个较为严峻的社会及健康问题，全球每年死于冠心病者超过700万人，2010年我国冠心病病人已超过千万，其罹患人群随着物质生活水平提高、体力劳动减少、人均寿命的延长呈现出逐年递增趋势，对人们身心健康的影响已不容忽视，早期筛查和诊断、准确评估病情是开展针对性防治的关键[1-3]。冠状动脉造影作为确诊及病情评估的最有价值指标虽得到公认，但其伴随的检查创伤也不可避免，而寻求无创、可靠的辅助指标仍有重要意义。血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)作为一种含硫氨基酸与脂质过氧化反应、内皮细胞损伤等血管病理过程紧密相关；高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein，HMGB1)是一个反映血管炎性反应的敏感标志物。本研究探讨Hcy、HMGB1与冠心病发生及严重程度之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年5月—2016年12月就诊于我院的冠心病病人129例，设为病例组；同期于体检中心选取60名健康体检者，设为对照组。病例组，男77例，女52例；年龄35～77(56.95±7.02)岁；体质指数18.23～27.55(23.19±1.85) kg/m2。对照组，男35例，女25例；年龄30～81(55.85±8.01)岁；体质指数17.85～27.96(23.35±1.92)kg/m2。两组临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 ①病例组诊断满足《美国冠心病诊断与治疗指南·第2版》[4]且经冠状动脉造影检查进一步确诊，对照组为健康人群且无冠心病家族史；②年龄>18岁，临床资料完整；③对本研究知情并签署同意书，且通过我院伦理委员会审批。

1.2.2 排除标准 ①合并先天性心脏病、心肌病、心瓣膜病、心力衰竭(无法控制)、风湿性心脏病等冠心病以外其他心脏病或恶性肿瘤等严重危及生命基础病者；②孕妇、哺乳期妇女、神经精神异常等无法研究者；③无法进行血Hcy、HMGB1检测或近期接受激素、免疫抑制剂等可能影响检测指标者。

1.3 病例组分组方法 ①依据冠心病不同类型，将急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)、稳定型心绞痛(stable angina pectoris，SAP)者分别设为ACS组(78例)、SAP组(51例)。②依据冠状动脉造影结果，将冠状动脉受累数量为1支、2支、≥3支者分别设为单支组(56例)、双支组(37例)、多支组(36例)。③采用Gensini积分法评估冠状动脉狭窄程度，将总积分>49.0分、>17.0分且≤49.0分、≤17.0分者分别设为重度组(34例)、中度组(42例)、轻度组(53例)。

1.4 检查及检测方法

1.4.1 冠状动脉造影 与两名具有副高级以上职称介入科医师，采用Judikin法[5]经数字减影血管造影机(型号：Allura Xper FD-20；厂家：荷兰PHILIPS公司)，同时参照Gensini积分系统进行逐一评定。

1.4.2 血Hcy、HMGB1检测 病例组入院第2天清晨、对照组于体检当天，取安静30 min、空腹8 h以上外周静脉血，每管约5 mL，离心后(3 500 r/min、15 min)将血清保存于-70 ℃的冰箱中备用。血清Hcy采用S-腺苷水解酶法、HMGB1采用酶联免疫吸附法，经全自动化学发光免疫分析仪(型号：Asvia Centaur XP型；厂家：德国西门子公司)检测，操作分别按照深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、上海荣盛生物药业有限公司、日本世诺临床诊断制品株式会社提供的试剂盒说明书进行，血Hcy、HMGB1的正常范围分别为0～15 μmol/L、2.5～80.0 μg/L。检验操作在我院同一名高年资检验技师的指导下由两名经验丰富的检验技师独立完成。

2 结 果

2.1 病例组与对照组血Hcy、HMGB1水平比较 病例组血Hcy、HMGB1水平高于对照组(P<0.05)。详见表1。

组别样本量Hcy(μmol/L)HMGB1(μg/L)病例组12925.82±4.85214.35±41.05对照组605.33±1.4135.04±9.14t值19.00829.114P0.0000.000

2.2 冠心病不同分型组血Hcy、HMGB1水平比较 冠心病不同分型组血Hcy、HMGB1水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。血Hcy：ACS组高于SAP组、对照组(q=11.365，P=0.007；q=15.207，P=0.000)，SAP组高于对照组(q=10.298，P=0.011)。血HMGB1：ACS组高于SAP组、对照组(q=12.658，P=0.002；q=16.521，P=0.000)，SAP组高于对照组(q=9.254，P=0.019)。详见表2。

组别样本量Hcy(μmol/L)HMGB1(μg/L)ACS组7835.69±4.35305.47±42.24SAP组5115.05±2.62①162.36±38.52①对照组60 5.33±1.41①② 35.04±9.14①②F值57.48738.696P0.0000.000

与ACS组比较，①P<0.05；与SAP组比较，②P<0.05。

2.3 冠状动脉受累不同支数组血Hcy、HMGB1水平比较 冠状动脉受累不同支数组血Hcy、HMGB1比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。血Hcy：多支组高于双支组、单支组、对照组(q=8.269，P=0.025；q=9.699，P=0.012；q=19.888，P=0.000)，双支组高于单支组、对照组(q=9.658，P=0.006；q=18.951，P=0.000)，单支组高于对照组(q=13.526，P=0.000)。血HMGB1：多支组高于双支组、单支组、对照组(q=9.102，P=0.021；q=11.145，P=0.009；q=22.521，P=0.000)，双支组高于单支组、对照组(q=10.256，P=0.011；q=19.695，P=0.000)，单支组高于对照组(q=14.159，P=0.000)。详见表3。

组别样本量Hcy(μmol/L)HMGB1(μg/L)多支组3640.28±2.65351.57±35.69双支组3734.93±3.57①211.33±35.56①单支组5615.04±2.49①②124.26±35.01①②对照组605.33±1.41①②③35.04±9.14①②③F值71.26639.583P0.0000.000

与多支组比较，①P<0.05；与双支组比较，②P<0.05；与单支组比较，③P<0.05。

2.4 冠状动脉不同狭窄程度组血Hcy、HMGB1水平比较 冠状动脉不同狭窄程度组血Hcy、HMGB1水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。血Hcy：重度组高于中度组、轻度组、对照组(q=9.514，P=0.013；q=11.859，P=0.005；q=24.147，P=0.000)，中度组高于轻度组、对照组(q=11.574，P=0.002；q=22.352，P=0.000)，轻度组高于对照组(q=10.951，P=0.000)。血HMGB1：重度组高于中度组、轻度组、对照组(q=10.532，P=0.011；q=12.696，P=0.003；q=26.369，P=0.000)，中度组高于轻度组、对照组(q=12.455，P=0.000；q=23.663，P=0.000)，轻度组高于对照组(q=13.524，P=0.000)。详见表4。

组别样本量Hcy(μmol/L)HMGB1(μg/L)重度组3441.56±2.52 396.33±32.48中度组4235.17±2.72①214.49±33.24①轻度组5314.99±2.51①②139.06±30.07①②对照组60 5.33±1.41①②③ 35.04±9.14①②③F值76.22631.557P0.0000.000

与重度组比较，①P<0.05；与中度组比较，②P<0.05；与轻度组比较，③P<0.05。

2.5 相关性分析 病例组血Hcy、HMGB1水平与冠状动脉受累支数呈正相关(r=0.707，P=0.004；r=0.599，P=0.000)，与Gensini积分呈正相关(r=0.597，P=0.022；r=0.651，P=0.011)，病例组血Hcy与HMGB1呈正相关(r=0.658，P=0.000)；对照组血Hcy与HMGB1无明显相关性(r=0.142，P=0.856)。

3 讨 论

Hcy在机体内主要由半胱氨酸、蛋氨酸代谢产生，并以自体二聚物、与血清蛋白二硫键结合、自由硫醇等状态存在，其主要代谢途径包括释放至细胞外、转硫化、再甲基化，各种因素所致的血Hcy增高均可对血管系统形成较多负面影响，其影响冠心病的机制有[6-10]：①血管内皮细胞产生的一氧化氮(NO)可通过结合血Hcy进而对抗NO对血管的氧化损伤，但当血Hcy过度蓄积时，局部自由基等氧化物浓度大大提升，不仅可通过抑制NO合酶活性而减少其生成量，而且可直接促进NO降解，受损内皮细胞生成NO异常、Hcy损害血管内皮形成恶性循环；②偏高的血Hcy在遇到Fe3+、Cu2+时可产生大量OH-、过氧化氢(H2O2)，可通过腺苷三磷酸(ATP)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)丢失、二十二碳六烯酸(DHA)受损、脂质过氧化、谷胱甘肽氧化等途径损害冠状动脉壁；③血Hcy浓度过高可通过干预脱甲氧基姜黄素、活化转录因子4(ATF-4)等基因的表达进而增加细胞应激反应及其对含巯基氨基酸的敏感度，冠状动脉受损的危险度也随之提高；④过高的血Hcy与甘油二酯、蛋白激酶C的结合可促进C-myb等原癌基因表达，Hcy对缓激肽、硫酸乙酰肝素等的促进作用和内皮素-1、细胞间黏附分子-1(ICAM1)的抑制作用均可使内皮细胞功能紊乱，Hcy通过增加白介素-6含量、促进血小板源性生长因子-BB分裂损伤内皮细胞，Hcy增强基质金属蛋白酶抑制剂活动、促进内源性钙释放形成干预平滑肌内胶原合成及代谢，均可促进平滑肌增殖；⑤异常增多的Hcy可减少血小板存活时间，增加血栓烷A2含量及血小板黏附性、聚集性，增强Ⅻ、Ⅹa、Ⅴ因子及组织因子活性，抑制血管性血友病因子的加工及分泌，Hcy生成的过氧化物通过下调硫酸肝素表达进而减少凝血酶Ⅲ活性及含量，Hcy上调凝血调节蛋白的表达、抑制蛋白C抗凝活性促进血栓形成，均可增加血液黏度，促进冠状动脉粥样斑块形成；⑥Hcy异常代谢生成大量OH-、H2O2，不仅损伤内皮，而且促进胆固醇沉积及泡沫细胞、粥样斑块形成，Hcy过多可影响内质网中蛋白质的折叠与转运及血管壁内糖蛋白分子的纤维化结构，从而导致血管异常。本研究结果显示，对血Hcy，ACS组>SAP组>对照组，多支组>双支组>单支组>对照组，重度组>中度组>轻度组>对照组(P均<0.05)，且病例组随着冠状动脉受累数量、Gensini积分的增加而增高，与以上观点吻合，提示血Hcy可能参与冠心病发生，且与其严重程度呈正相关。

HMGB1主要由活化的巨噬/单核细胞及受损、坏死细胞分泌，本质是一种核蛋白，因电泳迁移率快而得名，高度保守，其与血管病的关系被广泛关注。其影响冠心病的途径有[11-15]：①HMGB1与晚期糖基化终末产物(RAGE)受体或Toll样受体发生结合反应时，以促分裂素原为中介，进而激活蛋白激酶、核转录因子κB，使NO生成减少、胆固醇转运受抑，最终对血管平滑肌趋化移行形成诱导、动员作用，促进后者增殖、迁移及泡沫细胞形成，导致动脉粥样硬化或冠状动脉损伤后再狭窄发生；②HMGB1与RAGE、Toll样受体2/4结合后，核转录因子κB异常表达，髓样分化蛋白88随着二硫基苏糖醇、髓样分化蛋白2的活化而激活，可促进炎性因子、趋化因子、肿瘤坏死因子等的释放及MHCⅡ类分子的表达，从而形成恶性循环；③血小板聚集、脂质沉积可引发损伤冠状动脉壁，使丰富表达于细胞内皮的HMGB1大量释放，又可刺激内皮形成大量的黏附因子[细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1(VCAM1)等]、趋化因子[白介素-8(IL-8)等]、细胞炎性因子等，降低局部血栓调节蛋白含量，从而促进脂纹形成；④少量HMGB1来源于血小板，通过与炎性因子相互作用而促进基质金属蛋白酶生成，可导致纤维帽裂解、斑块破裂，诱导血栓形成。此外，有研究显示，HMGB1可加重心肌缺血再灌注损伤，但低浓度HMGB1可通过诱导干细胞增殖分化而促进心肌梗死后修复及组织再生[16-19]。本研究结果显示，对血HMGB1，ACS组>SAP组>对照组，多支组>双支组>单支组>对照组，重度组>中度组>轻度组>对照组(P均<0.05)，且病例组随着冠状动脉受累数量、Gensini积分的增大而增高，与以上观点一致，提示血HMGB1可能参与冠心病发生，且与其严重程度呈正相关。

本研究还发现病例组血清Hcy与HMGB1呈正相关，可能是二者共同参与冠状动脉壁内皮损伤、脂质过氧化反应、泡沫细胞和血栓形成、脂质沉积、血管平滑肌异常等冠心病重要环节并相互促进所致，提示二者紧密相关且同时检测可相互印证。

总之，血Hcy、HMGB1参与冠心病的发生且与其严重程度呈正相关，可考虑联合检测以辅助冠心病的筛查、诊断及病情评估。但由于样本量相对小，部分数据仍需深入、分层分析才能得到更为客观的结论。