猪场废水培养小球藻工艺优化

王忠江，李 泽，王贵祥，王子越，孙 玮，姚纪宇

（东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）

微藻为通过光合作用自养低等植物，适应能力较强，分布广泛，光照、温度、二氧化碳、pH和营养物质（N、P、K、Mg 等）适宜条件下生长迅速[1]。微藻细胞含有丰富油脂、维生素、蛋白质、脂肪酸、氨基酸和糖类等高附加值物质。小球藻为微藻领域研究较多藻种[2]。小球藻富含天然β-胡萝卜素和叶黄素，有较强抗氧化能力，对新陈代谢产生的自由基有去除效果，广泛应用于医药行业[3]。改变培养环境提高小球藻中油脂含量，油脂经热解和提纯后可作为生物燃油[4]。小球藻吸收富营养化水体中N、P、K 等物质，对重金属水净化效果明显[5]。目前获取小球藻主要通过培养基培养方法，在配制培养基时需添加大量N、P、K 和C等营养成分及微量元素，主要依赖化学试剂，增加小球藻生产成本[6]。研发高性价比氮磷培养基质成为后续微藻产业发展关键。

我国猪场数量庞大，多以规模化养殖为主，每年产生大量猪场废水。猪场废水具有浊度高、臭味大、污染物浓度高，富含有机物、NH3-N、SS、TP等特点，如未经处理直接排放将成为污染源。目前猪场废水处理是制约我国生猪养殖产业健康发展的瓶颈问题。

利用富含氮磷猪场废水培养小球藻，可有效处理猪场废水并显著降低微藻培养成本[7-8]。利用猪场废水开展微藻培养研究中，需先对废水作高温、高压、臭氧等灭菌预处理[9-10]，过程工序繁杂，增加微藻培养成本。因此，本文针对猪场废水特点，以及目前猪场废水用于微藻培养存在问题，探讨未灭菌猪场废水直接培养小球藻可行性并优化培养工艺。

1 材料与方法

1.1 废水预处理

猪场废水取自黑龙江省哈尔滨市香坊区幸福镇光明村。取回猪场废水先用纱布过滤浮渣等杂质后取其清液，过滤后猪场废水pH 7.36，TN 4 857.32 mg·L-1，NH3-N 4 385.63 mg·L-1，TP 145.37 mg·L-1，COD 22 364.42 mg·L-1，浊度3 252.53 NTU。原猪场废水中氨氮和COD 含量较高，为避免对后续小球藻培养产生抑制，将原废水稀释10倍后作为小球藻培养液，保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2 藻种及培养

蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，藻种编号为FACHB-5，小球藻在BG11培养基中培养至对数期后备用。

1.3 方法

1.3.1 猪场废水培养小球藻单因素试验

废水添加比单因素试验：将猪场废水和BG11培养基混合物作为小球藻培养基，废水添加比设定为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，将预先扩培同一批次小球藻接种至猪场废水混合培养液。每个试验组设3 个平行，小球藻初始接种OD680为0.1（±0.05）， 调节pH 7.0，光照强度4 000 lx， 温度（26 ± 1）℃， 曝气强度2.0 L·min-1，光照周期为24 h/0 h（L∶D），培养周期为4 d。每日定时摇瓶并取样测量OD680，确定优化废水添加比范围。

初始pH 单因素试验：设定废水添加比为20%，将小球藻培养液初始pH调至3.0、5.0、7.0、9.0 和11.0，每个试验组设3 个平行，培养周期为4 d，每日定时摇瓶，取样测量OD680，确定优化初始pH范围。

光照强度单因素试验：设定废水添加比为20%，调节pH 7.0，分别以2 000、4 000、6 000、8 000 和10 000 lx 光照强度培养4 d，每个试验组设3 个平行，每日定时摇瓶，取样测量OD680，确定优化光照强度范围。

1.3.2 二次正交旋转中心组合试验设计

二次正交旋转组合试验因素水平编码如表1所示。温度为（26±1）℃，曝气强度为2.0 L·min-1，光照周期为24 h/0 h（L∶D），培养周期为10 d。

以废水添加比x1、初始pH x2和光照强度x33个因素为变量，以小球藻生物量和氨氮去除率为响应指标Y1和Y2，通过统计分析建立多元回归方程，确定各因素对小球藻生物量和氨氮去除率的影响，利用Excel 2003和SAS软件优化猪场废水培养小球藻工艺。

1.4 分析方法

小球藻生物量测定采用光密度法：培养液中小球藻细胞密度与其在680 nm 处光密度值线性相关[11]，用紫外可见分光光度计（UV754N上海仪电分析仪器有限公司）测定活体藻液在680 nm处光密度值代表细胞密度。另因藻细胞密度较高，吸光值大于1培养液，在测定前适当稀释，使其测定值在0～1。氨氮使用荷兰SKALAR 连续流动分析仪测定，采用Excel 2003 和SAS 处理数据；采用Excel 2003分析差异显著性。

表1 因素水平编码Table 1 Experimental factors and levels

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 废水添加比对小球藻生长影响

猪场废水添加比对小球藻生长的影响如图所示。

由图1可知，小球藻在废水添加比小于50%培养液中均正常生长，废水添加比为20%组OD 值最高，第4 天时OD680达到最大值0.673，10%组次之，而50%组OD680虽呈升高趋势，但增速较低，说明废水添加比为50%时已对小球藻生长产生抑制作用。

当废水添加比为60%及以上时，各试验组OD680值在经前2 d 短暂停滞期后逐渐下降，随废水添加比升高，OD680值下降，速率升高，此时各试验组小球藻生长均受明显抑制，藻体大量絮凝沉淀在瓶底和瓶壁。由于废水添加浓度较高时，培养液中氨氮含量超过小球藻耐受阈值导致其死亡。本试验适宜废水添加比范围为10%～50%。

2.1.2 初始pH对小球藻生长影响

初始pH 对小球藻生长影响如图2 所示。可知，初始pH对小球藻生长影响较大。除初始pH为11.0 组OD680值基本保持不变外，其他各组OD680值在经历第1天快速升高后，从第2天开始各组OD680值变化规律出现差异，其中初始pH 为9.0 组OD680值处于上升趋势，而初始pH为5.0和7.0组OD680值从第2 天开始仍处于上升趋势，但上升速率与第1天相比均出现下降，初始pH 为5.0 组OD680值上升速率下降幅度较大。初始pH 为7.0 组OD680值上升速率下降后与初始pH 为9.0 组保持一致，试验结束时初始pH7.0 组OD680值达到2.213，为各试验组中最高。而初始pH 为3.0 组OD680值在经过第1 天上升后开始逐渐下降，第3 天时OD680值与初始pH为11.0 组OD680值持平，第4 天时OD680值甚至低于初始pH 为11.0 组。说明小球藻生长环境pH 适宜，初始pH为7.0中性环境更适宜小球藻生长[12]。本试验适宜初始pH范围为5.0～9.0。

2.1.3 光照强度对小球藻生长影响

光照强度对小球藻生长影响如图3所示。

由图3 可知，光照强度对小球藻生长影响较大。5个试验组OD680值变化呈一定规律，其中光照强度较低2 000 和4 000 lx 试验组OD680值均较低，两个试验组OD680值差别较小。由于猪场废水浊度较高，光透过性差，当光照强度较低时无法充分满足小球藻生长需要，致使光照强度较低2 000和4 000 lx 试验组OD680值均较低。随光照强度增加，各试验组OD680值增加，光照强度为8 000 lx 组OD680值处于较高水平。但当光照强度继续升高到10 000 lx 时，OD680值未升高，反而由8 000 lx 时0.973 降至0.682，与光照强度6 000 lx 试验组OD680值一致，说明光照强度并非越高越好。在本研究中10 000 lx 光照强度已超过小球藻光饱和范围，影响小球藻正常生长，与罗淋研究结果[13]一致。本试验适宜光照强度范围为6 000～10 000 lx。

2.2 正交旋转组合试验

为确定各因素间交互作用，优化猪场废水培养小球藻工艺条件，设计3因素5水平二次正交旋转组合试验，分别以OD680和氨氮去除率为响应值Y1和Y2，分析废水添加比、初始pH、光照强度对试验结果影响。

正交设计与结果如表2所示。

表2 正交设计与结果Table 2 Test plan and experimental data

2.2.1 方差分析

2.2.1.1 OD680

根据试验结果，利用SAS 软件作多元线性二次回归分析，得到回归模型并检验模型。经失拟性检验后可知，失拟平方和P=0.8059＞0.05 不显著，回归方程有意义。从回归方程方差分析可知回归方程P＜0.0001 高度显著，响应值与因素之间存在模型确定关系，说明所选模型合理；由回归方程回归系数检验可知OD680与各因素一级线性关系均高度显著；与x1×x2和x2×x3线性关系高度显著。最终得到响应值OD680与x1、x2、x3回归方程模型为：

Y1=2.807-0.338x1+0.344x2+0.079x3-0.047x1x2-0.005x1x3-0.05x2x3-0.038x12-0.496x22-0.228x32

将不显著回归项去掉，得到OD680与各因素间回归方程为：

Y1=2.807-0.338x1+0.344x2+0.079x3-0.047x1x2-0.05x2x3-0.038x12-0.496x22-0.228x32

2.2.1.2 氨氮去除率

经失拟性检验可知，失拟平方和P=0.2115＞0.05不显著，回归方程有意义。从回归方程方差分析可知回归方程P＜0.0001 高度显著，氨氮去除率与自变量之间为显著回归关系，说明所选模型合理；由回归方程回归系数检验可知单因素对响应值影响均极显著；两两交互作用中x1×x2和x2×x3线性关系高度显著。最终得到响应值氨氮去除率与x1、x2、x3回归方程模型为：

Y2=0.857- 0.102x1+ 0.1x2+ 0.027x3- 0.023x1x2-0.003x1x3-0.0023x2x3-0.081x12-0.157x22+0.857x32

将不显著回归项去掉，得到氨氮去除率与各因素间回归方程为：

Y2=0.857- 0.102x1+ 0.1x2+ 0.027x3- 0.023x1x2-0.0023x2x3-0.081x12-0.157x22+0.857x32

2.2.2 响应曲面分析

为研究废水添加比、初始pH 和光照强度间交互作用，利用SAS 软件绘制响应曲面图和等高线图，并分析各因素间两两交互作用，确定最佳因素水平范围，得到最优因素组合及最优工艺，确定最大响应值。

本研究中废水添加比与光照强度交互作用对OD680和氨氮去除率影响不显著，因此未作分析。其余因素两两交互作用响应曲面图和等高线图如图4～7所示。

光照强度为8 000 lx时，初始pH和废水添加比对小球藻生物量影响见图4。

由图4a可知，响应值OD680在初始pH方向坡度较大，即OD680受初始pH 影响更显著，且随初始pH增大，小球藻OD680在一定范围内逐渐增大；但当pH大于7.4后，随初始pH增大，小球藻OD680反而逐渐降低，与单因素试验得出小球藻OD680随初始pH变化规律一致。废水添加比对OD680影响也是先增后减。当初始pH 为7.44，废水添加比为24.3%时OD680达到最大2.95。由图4b 可见，等高线沿初始pH方向分布更密集，说明初始pH与废水添加比相比对OD680影响更大。当废水添加比在21%～28%，初始pH在7.2～7.7时OD680值较高。

废水添加比为30%时，初始pH 和光照强度对小球藻生物量影响情况见图5。由图5a可知，最大值位于试验区内部，表明得到小球藻最大生物量。图5b 可知，等高线沿初始pH 方向分布更密集，说明初始pH 与光照强度相比对OD680影响更大。当初始pH 在7.1～7.8，光照强度在7 600～8 800 lx范围时OD680较高。

光照强度为8 000 lx时，废水添加比与初始pH对废水中氨氮去除率影响见图6。可见，氨氮去除率OD680随废水添加比与初始pH变化规律一致，初始pH对氨氮去除率影响更大，说明氨氮去除与小球藻生物量增加直接相关，氨氮作为小球藻营养被利用，与马红芳等研究结果[14]一致。由图6b 可见，废水添加比和初始pH存在明显交互作用，最佳氨氮去除率在试验区域内，当废水添加比在19%～24%，初始pH 7.1～7.5 时，废水氨氮去除率较高。

废水添加比为30%时，初始pH 和光照强度对氨氮去除率影响情况见图7。可见，氨氮去除率与图5 中OD680随废水添加比和初始pH 变化规律一致，初始pH与光照强度相比对氨氮去除率影响更大，随初始pH增大而增大；但当初始pH＞7.4，氨氮去除率随初始pH增大而减小。由图7b可知，废水添加比和初始pH存在明显交互作用，最佳氨氮去除率在实验区域内，当初始pH在7.1～7.7，光照强度在7 700～8 500 lx时，废水氨氮去除率较高。

2.2.3 参数寻优

为确定猪场废水作为营养液培养小球藻最佳工艺条件参数，本文使用Matlab Optimization Toolbox，使用fminimax 函数模块，采用序列二次规划算法对回归模型作有约束目标优化求解。多目标优化初始参数、边界值和返回值如表3所示。

当培养条件设定为废水添加比21.75%，初始pH 7.44，光照强度8 150 lx 时，可达到OD680与氨氮去除率理论最大值。OD680最大值为2.9375，氨氮去除率最大值为91.25%。

表3 工艺参数优化结果Table 3 Optimum analysis of technology parameters

2.2.4 验证分析

为检验最终模型可靠性，采用废水添加比21.75%、初始pH 7.44、光照强度8 150 lx较优工艺参数培养小球藻，开展验证试验。经10 d 培养后OD680达到2.91，废水中氨氮去除率为89.54%，与理论预测值较为接近，两个指标理论值和实际值误差均在2%内，说明本研究模型模拟效果良好。

3 讨 论

目前针对猪场废水开展微藻培养研究均需先对废水作高温、高压等灭菌预处理，增加猪场废水培养微藻难度及成本，本研究以未灭菌处理猪场废水作小球藻培养。单因素试验通过猪场废水添加比研究发现，当废水添加比小于50%时，小球藻在未灭菌猪场废水混合液中均正常生长，表明未灭菌猪场废水可直接用于培养小球藻。通过研究小球藻培养液初始pH 发现，小球藻在初始pH 5～9 时生长状况较好，其中以pH 为7 中性环境生长最佳，说明小球藻更适于中性生长环境。通过对光照强度研究发现，由于猪场废水浊度较高，当光照强度处于2 000～4 000 lx 较低水平时，小球藻生长速率较低，随光照强度增加，小球藻生长速率也随之增加，光照强度为8 000 lx 时小球藻生长速率达较高水平，但光照强度继续升至10 000 lx 时，OD680值下降，说明光照强度并非越高越好。

正交旋转组合试验可见，废水添加比与光照强度交互作用较弱，而初始pH与废水添加比和光照强度交互作用较强，初始pH与废水添加比和光照强度相比对OD680和氨氮去除率影响更显著。研究表明，培养液中氨氮去除与小球藻生物量增加相关，说明氨氮主要作为小球藻营养，小球藻具有较高降解和利用废水中氨氮能力，可用于高氨氮废水处理。本试验中的小球藻为批量培养，培养周期相对较短，后续需开展小球藻连续培养研究，验证和优化猪场废水在小球藻长期连续培养过程中工艺控制参数，为不灭菌猪场废水直接开展微藻培养工业化生产提供理论基础。

4 结 论

a. 未灭菌猪场废水可直接用于小球藻培养，通过单因素试验确定废水添加比、初始pH和光照强度对小球藻生物量影响规律。

b.通过二次正交旋转组合试验，确定废水添加比、光照强度和初始pH对小球藻生物量和废水氨氮去除率影响数学模型，并确定猪场废水培养小球藻最佳工艺条件为废水添加比21.75%，初始pH 7.44，光照强度8 150 lx。