一种新的油桐黑斑病病原及其生物学特性研究

徐红梅 邓先珍 杜洋文

摘 要：本文报道了湖北省武陵山区一种新的油桐黑斑病病原真菌，并对其开展了生物学特性和对农药敏感性研究。从油桐黑斑病发病叶片中分离到的JF-4菌株生长迅速，致病力强。菌株培养性状、产孢特征结合核糖体rDNA基因转录间隔区（ITS）和RNA聚合酶次大亚基基因（RPB2）分析表明该菌为小新壳梭孢Neofusicoccum parvum。该病原菌对环境适应能力较强，对5种供试杀菌剂敏感性不同，43%戊唑醇悬乳剂抑菌率最高。

关键词：油桐黑斑病;病原鉴定;生物学特性;毒力测定

中图分类号：S763.1   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2020）01-0027-04

Abstract：A newly identified pathogen of Mycosphaerella aleuritidis and its biological characteristics was studied in this paper.Isolated from diseased leaves，the pathogen of JF-4 grew rapidly with strong pathogenicity.Based on cultural character，sporogenous structure，ITS with RPB2 analysis，Neofusicoccum parvum was the newly identified pathogen.The mycelia could grow under different environment with good acclimatization.Toxicity of 5 fungicides to the pathogen was tested in the lab. Different fungicides inhibited the growth of mycelia at different levels，and 43% tebuconazole SE showed best effect.

Key words：Mycosphaerella aleuritidis;pathogen identification;biological characteristics;toxicity test

油桐是大戟科油桐属植物统称，是中国特有的油料树种，其种子中含有的桐油不仅是重要的工业油料，也是生物柴油的主要原料之一。油桐在中国亚热带地区的丘陵地带种植范围较广。武陵山区自然条件适于种植油桐，历史上一直是中国桐油中心产区。油桐产业是该区重要的特色资源产业[1]。

良好的抚育管理措施是保证油桐丰产、高产的前提条件，病虫害防治是油桐栽培管理的关键环节[2]。油桐黑斑病又称为角斑病，果实黑疤病，能引起严重的枯果和落果。在油桐产区发生普遍，该病主要发生在叶片、叶柄和果实上，病叶初期出现褐色小点，逐渐扩大成圆斑或因受叶脉的限制而成多角形的病斑，多数病斑可以相互联合成大块斑。病害严重者，全株枯死。过去认为，该病主要由油桐尾孢菌Cercospora aleuritidis Miyake.侵染所致[3-4]。

作者对湖北省武陵山区油桐病虫害进行了调查，其中油桐黑斑病发生十分严重。本文对该地一株新的油桐黑斑病病原进行了鉴定和生物学特性研究，以期为病害发生规律及防治研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病原物

黑斑病发病叶片源自湖北省来凤县百福司镇沙道湾村油桐林，供试JF-4菌株采用组织分离法分离并纯化后保存于4 ℃冰箱备用。

1.2 致病性测定

采用离体接种法测试JF-4菌株的致病性。油桐健康叶片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康叶片，放入保鲜盒中，取长满培养皿的菌丝块紧贴在叶片表面，对照加无菌培养基块，25 ℃恒温培养，保持90%相对湿度。48 h后观察叶片发病情况，并记录发病症状。将发病叶片进行组织分离，获得再分离菌株，与原接种菌株进行对比。依照柯赫氏法则判定菌株是否为致病菌

1.3 病原菌的培养性状、产孢结构观察与分子测序

将JF-4菌株接种在PDA平板上，25 ℃培养3 d，观察培养性状和特征，主要包括生长速度、菌丝颜色、是否有气生菌丝、菌落结构及色素产生情况等;观察病斑组织的解剖特征并将菌株接种在水琼脂添加无菌松针（马尾松）培养基，25 ℃恒温黑暗培养25 d左右，近紫外光照射（诱导产孢）。挑取载孢体，在光学显微镜下观察、记录产孢结构和孢子形态特征。

病原物基因組提取采用微波炉裂解法。核糖体DNA内转录间隔区（ITS1-5.8S-ITS2）基因扩增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[5]，RNA聚合酶次大亚基基因（RPB2）扩增采用引物RPB2bot6F（5′-GGTAGCGACGTCACTCCC-3′）和RPB2

bot7R（5′-GGATGGATCTCGCAATGCG-3′）[6]（PCR扩增反应条件为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。病原物ITS和RPB基因序列进行BLAST比对后获得多个匹配的序列记录，用CLUSTAL X软件包进行多序列比对。

1.4 病原菌生物学特性研究

1.4.1 温度对病原菌菌丝生长的影响

将供试菌株在25 ℃恒温箱中预培养3 d，于菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种于PDA平板上，分别置于10、15、20、25、30、35、40 ℃恒温箱中培养，每个处理重复3次，4 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.2 pH值对病原菌菌丝生长的影响

用1 mol·L-1 HCL和1 mol·L-1 NaOH调节PDA培养基的pH值至4、5、6、7、8、9（酸度计测量pH值）。按1.4.1所述方法分别接种菌饼于不同pH值PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养。每个处理重复3次，4 d后测量菌落直径。

1.4.3 碳源和氮源对病原菌菌丝生长的影响

以查彼培养基为基础培养基（硝酸钾2.0 g，磷酸氢钾1.0 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1 000 mL）。供试碳源为葡萄糖30.0 g，甘露醇27.6 g，可溶性淀粉24.55 g，麦芽糖27.25 g，蔗糖25.9 g（用量以葡萄糖30.0 g含碳量10.9 g为标准进行换算），灭菌后接种，以无碳源处理作为对照。每个处理重复3次，置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后测量菌落直径。

供试氮源为硝酸钾10.0 g，尿素3.0 g，硫酸铵6.6 g，甘氨酸7.5 g，硝酸铵4.0 g（用量以硝酸钾10.0 g的含氮量1.4 g为标准进行换算），灭菌后接种，以无氮源处理作为对照。每个处理重复3次，置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后测量菌落直径。

1.4.4 不同杀菌剂对病原菌菌丝生长的毒力测定

在无菌操作条件下，将供试杀菌剂分别用无菌水稀释成所需浓度10倍于供试浓度的5个系列浓度梯度的药液。向培养皿中加入药液1 mL，再加入9 mL冷却至50～60 ℃的PDA培养基，充分混匀，最终配制成所需浓度的含药培养基，以不含药剂的培养基作为对照，每个浓度重复4次。供试药剂和使用浓度见表1。

采用生长速率法对菌丝生长进行室内毒力测定[7]：在每个含药剂平板中央接入一块直径为5 mm的菌饼，25 ℃恒温箱中培养4 d后测量菌落直径，根据以下公式计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率。所得数据经SPSS19.0统计软件进行数据处理，求出各药剂毒力回归方程、EC50及相关系数。

抑菌率（%）=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-菌病直径×100

2 结果和分析

2.1 病原物致病性

叶片接种JF-4菌株3 d后出现褐色病斑，病斑形状不规则，在25 ℃恒温和高湿环境下，病斑扩展迅速，15 d后部分供试嫩叶整叶褐化坏死。发病叶片组织分离后所得再分离菌株与接种菌株特征一致，符合柯赫氏法则。

JF-4菌株引起叶片产生黑斑病，为油桐黑斑病病原真菌。

2.2 病原物的培养性状、产孢结构观察及分子鉴定

JF-4菌株在PDA培养基上生长迅速，气生菌丝发达;生长初期菌落呈白色，后逐步转为灰色。在野外病株和人工接种病斑组织中观察不到该菌有性或无性繁殖结构，而该菌在诱导培养（含无菌松针的水琼脂+近紫外照射）条件下可產生子实体。分生孢子器梨形或球形，分生孢子单胞，近椭圆形。

PCR产物琼脂糖电泳结果显示，ITS和RPB2基因片段大小均在500bp左右。BLAST序列对比表明这两个基因序列与GenBank数据库中多个Neofusicoccum菌株的相似性达到100%。

结合JF-4菌株培养性状、产孢特征以及核糖体rDNA基因转录间隔区（ITS）和RNA聚合酶次大亚基基因（RPB2）序列分析[8-10]，将该病原菌鉴定为小新壳梭孢N.parvum，该菌是葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae菌物的无性型。

2.3 病原菌生物学特性

2.3.1 温度对病原菌菌丝生长的影响

该菌在10～40 ℃温度范围均能生长，25～30 ℃菌丝生长较快，其中25 ℃为最适生长温度，培养4 d后菌落平均直径为85.0 mm。高温和低温均不利于菌丝生长。当温度低于10 ℃或者高于40 ℃时，菌丝生长速度缓慢（见图1）。

2.3.2 pH值对病原菌菌丝生长的影响

该菌在pH值4～9范围内生长速度均较快，培养4d后菌落平均直径为54.3～85.0 mm;其中pH值为7是最适生长pH值，菌落平均直径为85 mm，pH值8～9时菌落生长速度稍微降低，菌落直径为72.7～80 mm（见图2）。由此可见，该菌对环境酸碱性适应性强。

2.3.3 碳源和氮源对病原菌菌丝生长的影响

该菌在供试5种碳源培养基中均能生长，菌落生长速度远大于缺碳对照，在葡萄糖培养基上菌落直径最大，培养4 d后菌落平均直径为85.0 mm，其次是蔗糖、淀粉和麦芽糖、甘露醇。总体说来，该菌利用环境中碳源能力很强。不同碳源培养基上菌落培养性状差异不大，葡萄糖为该菌菌丝生长的最佳碳源（见图3）。

从图4可以看出，该菌在供试5种氮源培养基中均能生长，菌落生长速度远大于缺氮对照，在硫酸铵培养基上生长速度最快，培养4 d后菌落菌落平均直径达到85.0 mm，其次是尿素、硝酸铵、硝酸钾和甘氨酸。总体说来，该菌利用环境中氮源能力很强。不同氮源培养基上菌落培养性状差异不大，硫酸铵为该菌菌丝生长的最佳氮碳源。

2.3.4 不同杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响

室内毒力测定结果表明，供试5种杀菌剂对该病原菌毒力不同，从大到小依次为：43%戊唑醇悬乳剂﹥50%多菌灵超微可湿性粉剂﹥12.5%氟环唑悬乳剂﹥70%代森锰锌可湿性粉剂﹥75%百菌清可湿性粉剂。43%戊唑醇悬乳剂对该病原菌的抑制效果最好，75%百菌清可湿性粉剂效果最差，各杀菌剂对油桐枯萎病的室内毒力测定结果见表2。

3 结论与讨论

本文报道了湖北省武陵山区一种新的油桐黑斑病病原真菌，并开展了病原菌生物学特性和对农药敏感性等研究，为研究该病害的发生规律和防治提供理论依据。

从油桐黑斑病发病材料中分离到的JF-4菌株生长迅速，致病力强。培养性状、产孢特征结合核糖体rDNA基因转录间隔区（ITS）和RNA聚合酶次大亚基基因（RPB2）分析表明该菌为小新壳梭孢。

生物学特性研究表明，该病原菌在10～40 ℃温度范围均能生长，最适生温度为25～30 ℃;病原菌在pH值4～9范围内生长速度均较快，表明病原菌对环境酸碱度适应能力较强，在酸性、中性和碱性土壤条件下均能快速生长。该病原菌能利用环境中的多种碳源和氮源，葡萄糖和硫酸铵分别为该菌菌丝生长的最佳碳源和氮源，在生产管理中应注意合理施肥。总体说来，该油桐黑斑病病原菌对环境适应能力很强，生长迅速，该生物学特性为其快速侵染和传播奠定了基础。

室内毒力测定结果表明，供试5种杀菌剂对该病原菌毒力不同。毒力较强杀菌剂为：43%戊唑醇悬乳剂、50%多菌灵超微可湿性粉剂和12.5%氟环唑悬乳剂;毒力较差杀菌剂为：75%百菌清可湿性粉剂和70%代森锰锌可湿性粉剂。生产过程中可以参考本研究结果，选择43%戊唑醇悬乳剂等杀菌剂防治此类油桐黑斑病。

参 考 文 献

[1]姚茂华.振兴武陵山区油桐产业的思考[J].凯里学院学报，2011，29（6）：87-89.

[2]方嘉興，何方.中国油桐[M].北京：中国林业出版社，1998.

[3]陈鹏，刘宏屏，王达明，等.云南油桐黑斑病危险性分析[J].林业调查规划，2006，31（2）：116-118.

[4]和波益，白如礼.福贡县油桐林油桐黑斑病的成因及防治措施[J].云南林业科技，1999，（3）：45-47.

[5]White TJ，Bruns S，Lee S，et a.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J.（eds.）PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，New York，Academic Press.1990：315-322.

[6]Pavlic D，Slippers B，Coutinho TA，et a.Multiple gene genealogies and phenotypic data reveal cryptic species of the Botryosphaeriaceae：a case study on the Neofusicoccum parvum/N.ribis complex.Molecular Phylogenetics and Evolution，2009（51）：259-268.

[7]FAO.Recommended methods for the detection and measurement of resistance of agricultural pests to pestcides[J].FAO Plant Prot Bull，1982，30（2）：30-36.

[8]邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学[M].北京：中国林业出版社，1984.

[9]张中义，冷怀琼，张志铭，等.植物病原真菌学[M].成都：四川科学技术出版社，1988.

[10]袁志林，陈益存，汪阳东.一种新发生的油桐叶枯病病原真菌[J].菌物学报，2011，30（4）：658-662.

（责任编辑：唐 岚）