低温氩氧等离子体处理的无机牛骨对MC3T3-E1细胞黏附、增殖及分化的影响

马凯 李昊 赵红梅 王永亮 刘杰 柏娜

青岛大学附属医院口腔修复科 青岛大学口腔医学院 青岛 266003

外伤、肿瘤、先天畸形造成的骨缺损以及种植外科常常需要用到骨移植技术。目前该技术预期效果最佳的是自体骨移植，但自体骨移植同时存在增加手术创伤及手术并发症等缺陷；此外，同种异体骨移植也是常用的骨移植技术，但该技术也存在感染和免疫反应等问题。综合这些因素，人工骨替代材料在骨移植技术中具有广阔的发展前景[1-2]。

无机牛骨是临床常用的骨替代材料，主要成分是羟磷灰石，为多孔颗粒状，能促进血管长入并能维持血凝块的稳定，为骨组织新生提供早期的营养供应[3]；但该材料只具有骨引导特性，不具有骨诱导特性[4]，且长时间放置于空气中，材料表面易吸附空气中的杂质从而影响其生物活性。作为合格的骨移植材料，良好的生物相容性是首要条件。虽然目前人工骨替代物在临床中应用广泛，但在人体研究中，人工骨替代物表现出重塑不完整的特征，常可检测到残留。临床上在骨缺损区植入人工骨替代物后，大部分患者需要6个月甚至更长时间的愈合期，这就延长了后期修复的时间。有学者[5]认为，骨移植术的成功也受到其他因素的限制，包括外科手术感染、宿主骨重塑能力、材料本身吸收不足及材料毒性等。因此，对无机牛骨材料进行适当的表面处理，是提高其成骨效率、改善骨缺损修复的有效路径之一。

等离子体（plasma）是用来描述电离气体的术语，分为热等离子体和低温等离子体。热等离子体作为一种表面涂层技术，可以将金属和陶瓷喷涂到其他材料上。金属颗粒如钛或银以及羟磷灰石都是通过热等离子体喷涂技术对牙科或骨科植入物进行处理来强化其生物相容性。与此相反，低温等离子体的温度较低，可以通过灭菌、凝血、伤口愈合和组织再生直接治疗活体组织，或通过将等离子体处理的材料植入活体组织进行间接治疗。在骨和软骨再生生物材料的处理中，低温等离子体具有潜在的优势，但目前关注无机牛骨替代物经低温等离子体处理后生物学效应的研究还较为少见[6]。

低温等离子体进行材料表面改性时，可以在短时间内于材料表面连接大量的、不同种类的化学功能团，使材料表面的反应活性显著改善；另外该工艺还具有效率高，能耗低，安全且无二次污染，简单易行，常压下操作时无需价格昂贵的真空设备和繁琐耗时的操作程序等优势。低温等离子体的这些优点使其具有在常温常压环境下对骨替代材料进行适当的表面处理的可能性，有望在植入前对骨替代材料的特性进行改善。本实验使用低温氩氧等离子体对无机牛骨进行表面活化，观察活化后的无机牛骨对成骨细胞黏附、增殖和分化的影响，探讨低温氩氧等离子体能否改善无机牛骨生物学特性，为临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 无机牛骨（块型，5 mm×10 mm×20 mm，烟台正海生物科技股份有限公司）；小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1（中国科学院上海细胞库），α-MEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/链霉素、CCK（cell counting kit）-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒、TritonX-100（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.1.2 主要仪器 AS400型低温氩氧等离子体发生装置（Plasmatreat GmbH公司，德国），BIOBASE-EL 10A型酶标仪（济南博科公司），CKX53型倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），Phenom Pro型扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）（Phenom公司，德国），Nexsa™ X型X射线光电子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）仪和Forma™8000型CO2培养箱（ThermoFisher公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和低温氩氧等离子体活化 将无机牛骨先用紫外线灯照射消毒2 h，消毒完毕后用无菌环切刀和医用无菌刀片将骨块制备成直径5 mm、高度2 mm的圆柱状骨块，制备完毕后再用紫外线灯照射消毒2 h，备用。使用低温氩氧等离子体对无机牛骨进行等离子体活化，设为实验组，不作处理的无机牛骨为对照组，每组3个样本。低温氩氧等离子体系统原理如图1所示，它是一个尺寸为33 cm×12.5 cm的辉光放电等离子体工作区，由射频功率为20 kHz的电源和匹配网络供电。调整设备参数为电压320 V，电流0.3 A，气体以500 L·h-1的速度流至喷射口，借助于与控制系统一起工作的集成式质量流量计，可以确保精确的流速。基板固定在铝板上，实验中将骨块固定在基板上距离低温等离子体喷射口2.5 cm的位置，以氩气＋体积分数5%氧气作为输出气体产生低温氩氧等离子体，处理骨块60 s[7]。

图 1 低温氩氧等离子体系统原理示意图Fig 1 Schematic diagram of low temperature argon-oxygen plasma system

笔者通过前期预实验结果发现，低温氩氧等离子体的处理时间与骨块表面温度和骨块表面形貌密切相关（图2）。

图 2 低温氩氧等离子体系统处理时间与材料表面温度的关系Fig 2 The relationship between treatment time of low temperature argon-oxygen plasma system and surface temperature of materials

处理时间为60 s时，骨块表面温度约为80 ℃，表面形貌没有明显变化；处理时间为60～100 s，表面温度会缓慢上升15 ℃左右；随着处理时间延长，表面温度稳定在这一水平不再升高，但是会出现骨块表面干裂及内部连接结构断裂的情况（图3）。为保证低温氩氧等离子体发挥其活化能力又不引起骨块表面形貌变化，本实验选用的处理时间为60 s。

图 3 温度过高导致骨块内部连接结构断裂 SEM × 2 000Fig 3 The excessive temperature caused the fracture of the internal connecting structure of the inorganic bone SEM × 2 000

1.2.2 SEM观测表面形貌 使用SEM观察实验组和对照组的表面形貌。SEM观察前，骨块表面涂覆钯金以获得更好的成像质量，加速电压为10 kV，放大倍数为2 000倍和10 000倍。

1.2.3 XPS分析表面元素组成 采用XPS仪对实验组与对照组进行表面元素和化学分析，收集高分辨率C1s、O1s、Ca2p和P2p的光谱。激发源采用Al kα射线（hv=1 253.6 eV），工作电压12.5 kV，灯丝电流16 mA，并进行10次循环的信号累加。测试通能为40 eV，步长为0.1 eV，并以C1s=284.60 eV结合能为能量标准进行荷电校正。实验组骨块在空气中暴露2 d后，再用同样的方法分析该组表面元素组成。

1.2.4 细胞早期黏附 使用24孔板，将MC3T3-E1细胞以每孔2×106个细胞的密度接种在实验组和对照组骨块上，放入培养箱中培养3 h后吸出培养液，磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水（30%、50%、70%、90%、100%乙醇各脱水15 min），喷金处理后于SEM下观察细胞形态。

1.2.5 细胞增殖实验 使用96孔板，调整MC3T3-E1细胞密度至每毫升3×105个，取100 μL细胞悬液接种于实验组和对照组骨块表面，2 h后沿孔壁边缘缓慢加入100 μL培养液，分别于培养2 h、4 h、1 d时在显微镜下观察细胞在骨块表面的生长情况。在1、3、5 d更换新鲜培养液，每孔加入新鲜培养液200 μL，随后每孔加入10 μL CCK-8试剂，将96 孔板置于培养箱中孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

1.2.6 细胞分化实验 使用96孔板，调整MC3T3-E1细胞密度为每毫升5×105个，取100 μL细胞悬液接种于实验组和对照组骨块表面，用含抗坏血酸成分的培养基培养。分别于培养第7、14天后使用磷酸盐缓冲液清洗3次，每孔中加入120 μL细胞裂解液，经反复冻融处理使细胞膜破裂，收集细胞，按ALP试剂盒说明书操作，使用酶标仪测定405 nm处OD值，根据公式换算出ALP的活性。

1.3 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为双侧α= 0.05。

2 结果

2.1 表面形貌

SEM观察显示，对照组与实验组的表面形貌没有明显差异，提示等离子体表面处理没有对骨块表面造成明显的损伤，仍表现为粗糙的表面（图4）。

图 4 实验组和对照组的表面形貌 SEMFig 4 The surface morphology of the experimental group and control group SEM

2.2 XPS检测

对照组与实验组的表面元素百分比如表1所示，可以看到两组骨块表面的元素组成相同，但百分比存在差异。实验组骨块表面碳（C）元素百分比减少，氧（O）、磷（P）、钙（Ca）元素百分比有所增加。

表 1 两组骨块表面元素百分比的XPS分析Tab 1 XPS analysis of the percentage of bone surface elements in two groups %

各个元素XPS峰值结果见图5。实验组经过低温氩氧等离子体处理后，在 531.1 eV 处O1s光电子强度提高，说明氩气（Ar）和氧气（O2）的混合气体在骨块表面产生了活性氧基团（图5B）；此外，实验组Ca2p（347.1 eV）、P2p（130.6 eV）的光电子强度也有明显增加（图5C、D）。实验组C1s在284.60 eV的光电子强度明显减少（图5A），说明低温氩氧等离子体可以有效去除骨块表面的有机杂质。

实验组处理后放置于空气中暴露2 d，再次进行XPS检测，结果见图6：实验组表面元素百分比呈现动态变化，骨块表面的碳（C）元素百分比明显增加，而氧（O）、磷（P）、钙（Ca）元素百分比均减少。

2.3 细胞早期黏附

两组骨块表面MC3T3-E1细胞的早期黏附情况见图7和图8。对照组：细胞大多呈球形黏附于材料表面（图7A），进一步放大可见细胞成球形且有伪足形成，但无明显铺展（图7B）。实验组：细胞多数为铺展状态，呈多边形（图7C红线标记处），进一步放大可见细胞铺展较为充分，周围延伸出厚而长的突触（图7D红线标记处）。由图8可见，实验组表面成骨细胞的黏附面积百分比高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4 细胞增殖

CCK-8法测定的MC3T3-E1细胞增殖结果见图9，随着时间延长，细胞在两组骨块上的增殖数量逐渐增加，对照组1 d与3 d、1 d与5 d的细胞增殖数量的差异有统计学意义（P<0.05），实验组1 d与5 d、对照组1 d与实验组5 d的细胞增殖数量的差异有统计学意义（P<0.01）；实验组在培养1、3、5 d时的细胞增殖数量均高于相应培养时间的对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。

图 5 XPS检测两组骨块表面元素的变化Fig 5 XPS detected changes in bone surface elements in the two groups

图 6 实验组即刻及暴露2 d后表面各元素百分比Fig 6 The percentage of surface elements in the experimental group after immediate and 2 days of exposure

2.5 细胞分化

MC3T3-E1细胞的ALP检测及分析结果见图10。由图10可见，随着时间延长，MC3T3-E1细胞在两组骨块上的ALP活性逐渐增加。对照组培养7 d与培养14 d、实验组培养7 d与培养14 d的ALP活性差异有统计学意义（P<0.05）。实验组在培养7 d时，MC3T3-E1细胞的ALP活性与对照组无明显差异（P>0.05），而在培养14 d时，MC3T3-E1细胞ALP活性明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

图 7 对照组和实验组表面MC3T3-E1细胞形态 SEMFig 7 MC3T3-E1 cell morphology on the surface of the control group and the experimental group SEM

图 8 实验组和对照组表面成骨细胞的黏附面积百分比Fig 8 Percentage of adherent surface area of osteoblasts in the experimental group and control group

图 9 MC3T3-E1细胞增殖结果Fig 9 Proliferation of MC3T3-E1 cells

图 10 MC3T3-E1细胞ALP活性检测结果Fig 10 ALP activity of MC3T3-E1 cells

3 讨论

作为近年来使用频率较高的一种骨替代物，无机牛骨具有良好的生物相容性，形态和化学结构与矿化人骨相似，因此在临床上应用广泛，并取得良好的成骨效果。但临床实践也发现，该材料存在不易被机体完全吸收的缺点，因此如何改善其成骨效果成为近年的研究热点。Schmitt等[8]用骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子修饰无机牛骨粉使其具有骨诱导功能，增强成骨效果，但蛋白质合成工序复杂、价格昂贵，植入体内可能会引起免疫反应或感染，限制其临床应用。高媛媛等[9]使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸构成的三肽序列（arginine glycine aspartic acid，RGD）修饰无机小牛骨粉来增强成骨效果，结果发现，无机牛骨与RGD物理结合后可促进细胞黏附及分化，但对细胞增殖没有促进作用，且RGD溶液的制备需严格控制浓度，临床推广存在一定的困难。由此可见，如能找到一种简单、高效的表面处理方式来增强无机牛骨的成骨效果无疑非常有助于其临床应用。

等离子体是一种由自由电子和带电离子为主要成分的物质形态，广泛存在于宇宙中，常被视为物质的第四态，被称为等离子态[10]。等离子体已广泛应用于工业表面处理，包括清洗、活化和表面镀膜[11]，而低温等离子体具有低温、高效的优势，近年来在生物医学领域受到广泛关注[11]。Duske等[12]采用低温氩气等离子体处理不同表面的钛片，之后复合成骨细胞进行培养，SEM下观察到处理组细胞的伸展程度明显提高。稀有气体的混合物，如氩（Ar）和氧（O2）以一定比例混合后，作为亚稳稀有气体种类可携带大量的能量，在低温等离子体的环境中可以通过能量转移反应导致活性氧物质的形成，使得材料表面能大幅增加[13]。由此推测，若使用氩气和氧气的混合气体产生的低温等离子体处理无机牛骨表面，可能会产生更理想的骨反应。

本实验使用氩气+5%氧气产生的低温氩氧等离子体处理无机牛骨块，通过SEM观测其表面形貌，可知对照组与实验组的表面形貌没有明显差异，说明低温氩氧等离子体不会破坏无机牛骨表面的结构，这与之前的研究[14-15]结果相同。低温氩氧等离子体处理骨块前后的XPS结果显示，实验组的氧（O）、钙（Ca）、磷（P）元素峰值均较对照组增高，而碳（C）元素峰值较对照组减少，这可能是因为等离子体处理后会引起材料表面的化学变化，具体表现为碳氢化合物含量的减少和羟基（-OH）、羧基（-COOH）等官能团的增加[16]。自然界中存在的碳元素会不可避免地附着在材料表面，碳在表面的吸附会引起生物活性降低[17]，从而影响无机牛骨和成骨细胞的结合；而等离子体的表面清洁[18]作用会有效去除无机牛骨表面的碳杂质，有利于成骨细胞的附着。França等[19]在2014年指出，从生物陶瓷中去除这些杂质是很重要的，因为它们会影响材料植入骨再生过程中的力学性能。因此笔者认为，低温等离子体可以去除材料表面的杂质，有利于细胞附着，后续实验结果进一步证实了这一推测。氧元素含量增加有助于增加材料表面能，促进细胞早期黏附，而钙、磷作为骨组织代谢中的重要元素，其含量的增加同样有利于细胞的早期附着及形成良好的细胞形态[20]。然而，低温等离子体处理材料后，表面化学构成随着时间延长也会发生改变。有学者[21]进行了低温等离子体处理钛片的相关实验，发现经过等离子体处理后的钛片表面的接触角均值随着在空气中放置时间的延长而迅速增大，本实验也发现实验组暴露于空气中2 d后，其表面元素发生了明显变化。这可能是由于材料表面官能团半衰期较短，表面氧化膜与空气中的碳氢化合物发生反应，材料亲水性下降[22]。

成骨细胞早期黏附的观测结果显示，对照组表面的成骨细胞呈球形，未见明显的伸展，而实验组表面的成骨细胞呈多边形扁平状，表现出良好的黏附和伸展性能，同时可以观察到成骨细胞在材料表面延伸出厚而长的突触。这一结果表明，经过等离子体活化后的无机牛骨有利于成骨细胞的早期黏附。这可能与等离子体处理后材料表面氧元素增加和碳杂质降低有关。有研究[23-24]证明，氧元素含量升高，碳元素含量降低有利于增加材料表面的亲水性和表面能，而材料的表面能在促进早期细胞黏附中起着重要作用。

本实验中细胞增殖检测结果显示，经过低温氩氧等离子体处理过的骨块表面细胞增殖明显高于对照组，说明经过活化的骨块表面可有效提高成骨细胞的增殖能力，这可能与骨块表面活性增加有关。研究[25]表明，生物材料的表面特征可以直接影响细胞反应，从而影响新组织的生长速度和质量。成骨细胞在分化早期即表达ALP，ALP被认为是细胞外基质成熟的早期标志，因此ALP检测是一种简单、经济的成骨细胞特异性检测方法。本研究ALP检测结果显示，实验组在7、14 d的成骨活性均高于对照组，说明等离子体的表面活化对骨形成具有一定的促进作用。

无机牛骨作为一种人工骨替代物，目前已经广泛应用于种植及引导组织再生领域。本实验使用低温氩氧等离子体对其进行活化，结果发现，经过处理的无机牛骨对细胞黏附、增殖及分化均有一定的促进作用，同时不改变材料本身的表面形貌及化学组成。综合本研究结果可以认为，低温氩氧等离子体活化的无机牛骨在增强成骨能力方面有良好的前景，但还需进一步研究。