基于质谱技术的脂肪酸定量分析及其与慢性疾病关系的研究进展

李 娜，李智立

(中国医学科学院基础医学研究所/北京协和医学院基础学院,生物物理及结构生物学系，北京 100005)

脂肪酸是含有羧基的链烃,其参与生命体的能量代谢，是细胞膜的主要成分。依据脂肪酸碳链长度可分为：碳原子数小于6的短链脂肪酸、碳原子数介于7～12的中链脂肪酸、碳原子数介于13～20的长链脂肪酸，以及碳原子数大于20的超长链脂肪酸；依据脂肪酸碳链饱和度可分为：饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸；根据不饱和脂肪酸第1个不饱和双键距离甲基端位置的远近可分为ω-3族、ω-6族、ω-9族脂肪酸等；根据不饱和脂肪酸双键的构型可分为顺式脂肪酸和反式脂肪酸。脂肪酸在人体内以游离脂肪酸(Free fatty acids，FFAs)和酯化脂肪酸(Esterified fatty acids，EFAs)两种形式存在。其中FFAs在生命体内占比较少[1]，绝大部分以EFAs形式存在，而EFAs主要以磷脂、糖脂以及脂蛋白等形式存在，其在血液运输中会与白蛋白结合。

脂肪酸会影响机体的生理功能及健康状态，越来越多的证据显示脂肪酸与炎症[2]、肥胖[3]、糖尿病[3-4]、癌症[5-7]以及阿尔茨海默氏病[8]等慢性疾病密切相关。

1 脂肪酸的检测

脂肪酸在高温下容易发生脱羧、裂解和热还原反应。应用气相色谱分离脂肪酸时，需要对脂肪酸进行衍生化，以增加其挥发性，降低极性，其中脂肪酸甲酯化是一种常用的衍生化方法[9-10]。在进行高效液相色谱分析之前，需利用衍生化试剂(如氯化萘[11-12]、邻苯二甲酸酐[13]、苯酐[14]和2-磺基苯二甲酸酐[15]等)进行柱前衍生化，引入紫外吸收基团后可用紫外检测器和二极管阵列检测器等对脂肪酸进行检测。近红外光谱法也是一种快速、高通量、低成本的脂肪酸分析方法[16]。采用核磁共振波谱法可通过添加苯甲酸作为内标物，开展脂肪酸的定量分析[17]。 质谱法可对脂肪酸等生物分子进行高通量的定性和定量分析[18-20]。本文主要综述了采用质谱法定量分析不同病理生理条件下脂肪酸含量及其与疾病关系的研究结果。

2 脂肪酸与慢性疾病

2.1 脂肪酸与糖尿病

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。以氨水处理的N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(NEDC)作为基质辅助激光解吸电离(MALDI)检测脂肪酸的基质，可降低NEDC基质效应的影响。通过建立定量分析曲线，对339例血清样本(包括161例健康对照、118例糖尿病患者、60例非糖尿病患者)中的7个血清FFAs(C16∶0、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶4和C22∶6)进行绝对定量分析。研究结果表明，上述FFAs在糖尿病患者中明显升高，且大多数脂肪酸的含量随着血糖值升高而呈上升趋势；受试者工作曲线分析结果表明，C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6的组合具有较高的诊断能力，可以区分健康对照和糖尿病患者或非糖尿病患者，其诊断精度、灵敏度和特异度分别大于0.97、90%和91%。该组合还可区分糖尿病患者和非糖尿病患者，其诊断精度、灵敏度和特异度分别为0.94、92.4%和83.3%[18]。通过碱水解方法可获得血清中的EFAs，采用基质辅助激光解吸电离-质谱分析了1 828例血清(包括543例对照、655例糖尿病前期患者、630例2型糖尿病)中的14种EFAs(C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶4、C22∶5和C22∶6)。研究结果揭示，C18∶1和C20∶3在3组人群中的表达水平具有显著差异；糖尿病患者血液中的EFAs水平显著高于健康对照和无高血糖患者[21]。高表达的饱和FFAs和ω-6 多不饱和脂肪酸会引起糖耐量受损和胰岛素抵抗[22]。血液中的FFAs增加可将脂肪酸储存在非脂肪组织，如肝脏、肌肉、心脏和胰岛。这种脂质异位沉积将导致代谢相关的细胞发生功能障碍，引起细胞程序性死亡。羟基脂肪酸脂肪酸酯是近年来发现的一类新型脂肪酸，其为羟基脂肪酸与脂肪酸的酯化反应产物，可促进胰岛素的分泌和葡萄糖的摄取，且具有抗炎作用[23-24]。

2.2 脂肪酸与癌症

采用NanoESI-FTICR MS技术对2 861例血清中的 6种FFAs(C16∶1、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6)与不同慢性疾病的关系进行了研究。通过建立定量分析标准曲线，对实验方法进行精密度、稳定性和加标回收率等考察后，实现了对上述6种FFAs的绝对定量分析。与健康对照比较，发现FFAs在胰腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌和甲状腺癌患者血液中的含量均呈下调趋势，而在非癌的慢性疾病患者血液中则呈现不同的变化趋势[6]；受试者工作曲线分析结果表明，C18∶2/C18∶1和 C18∶3/C18∶1的组合能够识别早期胰腺癌，其诊断精度、灵敏度和特异度分别为0.912、86.7%和88.6%[20]；C16∶1、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6的组合能够将早期肺癌与非癌人群区分开，其诊断精度、灵敏度和特异度分别为0.933、84.2%和89.1%[25]；C16∶1、C18∶3、C18∶2、C20∶4和C22∶6的组合能够识别早期胃癌[26]、结直肠癌[5]和乳腺癌[27]，其诊断精度、灵敏度和特异度分别优于0.82、80%和72%，且这些研究结果明显优于临床上使用的癌胚抗原和CA19-9等传统肿瘤标志物的诊断精度、灵敏度和特异度。采用碳纳米材料-氧化石墨烯作为MALDI MS分析的基质，对血清中的12种EFAs(C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6)进行绝对定量分析。研究结果表明，不同性别之间的脂肪酸含量无统计学差异，但不同病理生理状态下、不同年龄段之间的脂肪酸含量却存在统计学差异。与健康对照人群相比，肺癌患者的C16∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3含量均明显升高，肺部良性疾病患者的C20∶2、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6含量均明显下降。与临床常用的肿瘤标志物(癌胚抗原和细胞角蛋白19片段)相比，发现C18∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6的组合，C18∶0、C20∶4、C20∶5和C22∶6的组合以及C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶3和C22∶6的组合可区分肺部良性疾病患者和肺癌患者[19]。肺癌患者血清中FFAs及其氧化代谢物的水平显著升高，其中花生四烯酸、亚油酸和15-羟基二十碳四烯酸组合具有较好的区分腺癌与非癌的能力[7]。短链脂肪酸是肠道细菌发酵的关键代谢产物，饮食中的多聚糖在结肠内可被微生物代谢成低聚糖，然后发酵成乙酸、丙酸和丁酸等短链饱和脂肪酸，这些短链脂肪酸对人的能量代谢具有重要影响，与膳食纤维的抗炎作用和降低结肠癌患病风险密切相关[28-29]。

2.3 脂肪酸与心血管疾病

心血管疾病是一类涉及心脏或血管的疾病统称。前期研究采用LC-MS/MS技术在动脉粥样硬化斑块中检出C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、α-C18∶3、γ-C18∶3、C20∶4、 C20∶5和C22∶6等10种脂肪酸[30]。采用LC-MS对食用ω-3多不饱和脂肪酸降低心血管疾病发病风险的受试者血清中C20∶5和C22∶6进行测定，发现这些脂肪酸的血液浓度与动脉粥样硬化相关[31]。采用GC-MS对汉族正常人和冠心病患者血液中脂肪酸进行测定，发现C14∶0、C16∶0、C18∶0、trans-C18∶1、C22∶6、C20∶5和C20∶4脂肪酸与冠心病显著相关[32]。 对欧洲人群的研究发现，高表达的单不饱和FFAs与心血管风险有关[33]，而高表达的ω-6多不饱和脂肪酸能降低心血管疾病发生的风险[34]。对非糖尿病人群，血液中的ω-3和ω-6 多不饱和脂肪酸表达水平增加会降低未来患心血管疾病的风险[35]。C20∶5/C20∶4比值较高的人，其患心血管疾病的风险相对较低[36-37]。这些研究结果表明血液中FFAs的表达水平与心血管事件的发生密切相关。

3 总结与展望

脂肪酸作为人体内重要的代谢产物和能量来源，其种类及含量的变化对不同类型慢性疾病的发生、发展起着重要作用。脂肪酸与慢性疾病关系的研究，既要关注脂肪酸的种类及其含量变化，又要关注其更深层次的结构和构型变化[38]。将不同分离技术与质谱技术相结合，开展定性和定量的脂肪酸更精细的结构分类研究，从而建立脂肪酸“量变”和结构变化(“质变”)与慢性疾病发生、发展之间的关系，将是质谱学研究的重要方向之一。