线状纳米金修饰碳纤维超微电极检测芦荟大黄素

杨莉莉，王婷婷，鲍昌昊，程 寒,*

(1.中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074；2.中南民族大学 民族药学国家级实验教学示范中心， 湖北 武汉 430074)

芦荟大黄素(AE)化学名为1，8-二羟基-3-羟甲基蒽醌，属于蒽醌类化合物，为橙色针状结晶或土黄色结晶粉末，是一种从芦荟、大黄及决明子等中药材中提取的生物活性成分[1-2]。AE因具有清除氧自由基和抗肿瘤活性[3]、抗炎和抗菌活性[4]、降血压[5]和免疫抑制作用[6]等多种药理活性，而引起了国内外学者的广泛关注。目前已报道的AE检测方法多为高效液相色谱法(HPLC)，如尚海花等[7]用HPLC法同时测定夏黄颗粒中芦荟大黄素、大黄酸、厚朴酚、和厚朴酚、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，饶楠楠等[8]用HPLC法检测芦荟中8种蒽醌类物质，潘家峰[9]比较了微乳液相色谱法(MELC)与常规HPLC法检测大黄药材中5种蒽醌类衍生物成分含量的效果，却鲜有文献报道用电化学方法检测AE。而近年发展起来的电化学方法因具有灵敏度高、操作简单、成本低廉等优点在很多领域得到了广泛应用。

纳米金粒径小于100 nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子、小分子结合，性质稳定[10-13]。用柠檬酸三钠还原氯金酸得到的纳米金粒子表面带负电荷，通过电沉积方法可以使纳米金在碳纤维超微电极表面形成带负电荷的膜，从而制得表面带负电荷膜的修饰电极[14-15]。

本文采用化学还原法即柠檬酸三钠还原氯金酸制备了线状纳米金颗粒，通过电沉积方法将纳米金修饰至碳纤维超微电极(CFME)，通过优化电沉积时间，获得稳定性和电催化性能良好的修饰电极。该修饰电极对体系带正电荷的AE有显著的电催化作用，从而构建了对AE电化学检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XD-RFL实验室倒置显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；PTHW250ML型电热套(武汉科尔仪器设备有限公司)；PHS-3C型pH计(上海仪器科学仪器股份有限公司)；Ag/AgCl电极为参比电极；CHI660D化学工作站(上海辰华仪器公司)；JEOL-JSM-6500F扫描电子显微镜(SEM，日本电子)。

碳纤维(直径5 μm，吉林市神舟碳纤维有限责任公司)；氯金酸AuCl3·HCl·4H2O(纯度≥47.8%,国药集团化学试剂有限公司)；AE(纯度≥97%，上海源叶生物科技有限公司)；柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；碳粉导电胶(自制)；实验以pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液为底液，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 线状纳米金及修饰电极的制备

在圆底烧瓶中加入50 mL 0.01%的氯金酸溶液，置于电热套中边搅拌边加热直至沸腾，然后加入0.16 mL 1.0%的柠檬酸三钠溶液，在搅拌下持续加热直至溶液颜色不再变化，此时溶液呈蓝紫色。

将Ag/AgCl电极和已制好的CFME放入适量线状纳米金溶胶中,在+1.5 V恒电位下进行电沉积，使线状纳米金沉积于CFME表面，即在CFME表面形成纳米金修饰层，将电极取出后用水清洗，得修饰好的碳纤维超微电极，记为LGN/CFME。

1.3 电化学测定

电化学检测采用双电极体系：以LGN/CFME为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极。差分脉冲伏安法(DPV)实验参数为：电位扫描范围-0.3～0.3 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05 s，脉冲时间0.2 s，静止时间20 s。实验过程均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 LGN/CFME对AE的电催化氧化

考察了电极修饰前后对1.0×10-4mol/L AE的电催化效果。将CFME置于线状纳米金溶胶(图1A)中，于+1.5 V下电沉积12 min制得LGN/CFME。由扫描电镜图可见，未修饰的CFME(图1B)表面光滑平整，修饰后其(图1C)表面被一层纳米金包裹，电极直径略有增加，比表面积增大，可加快电极表面电子转移速率，从而提高对AE的检测效果。分别采用CFME和LGN/CFME在1.0×10-4mol/L AE中进行循环伏安测定，实验结果如图1D所示，氧化峰和还原峰均负移，其中前者Epa=-452 mV，Epc=-437 mV，ΔEp=15 mV(曲线a)；后者Epa=-510 mV，Epc=-440 mV，ΔEp=70 mV(曲线b)，说明AE在LGN/CFME上的电化学反应可逆性增加，电子转移速率增强，LGN对AE的氧化还原反应具有良好的催化作用。

2.2 修饰电极电沉积时间的优化

通过控制恒电位沉积的时间对线状纳米金的负载量进行控制，即在线状纳米金溶液中于+1.5 V下分别恒电位沉积0、3、6、9、12、15、18 min，检测1.0×10-4mol/L AE。结果如图2所示，修饰后的电极较未修饰电极的氧化峰电流均有明显增幅，随着电沉积时间的增加，修饰至电极表面的纳米金量增加，氧化峰电流不断增加。当电沉积时间达12 min时，峰电流增加幅度最大，此后，继续延长电沉积时间，则氧化峰电流略有下降，增幅趋于平缓，可能是由于电沉积时间较长使得纳米金在电极表面不断聚集，从而导致电极表面的修饰层部分脱落，电极的电催化活性降低。进一步考察不同电镀时间得到的修饰电极的氧化峰电流相对标准偏差，结果显示，电镀时间为12 min时，其相对标准偏差最小(0.42%)。综上，电极电沉积12 min时，修饰电极的电催化性能及稳定性最佳，因此本实验均采用12 min为最佳电沉积时间。

图1 线状纳米金的透射电镜图(LGN,A) 、碳纤维超微电极(CFME，B) 及纳米金修饰碳纤维超微电极

图2 1.0×10-4 mol/L AE在不同电沉积时间下的DPV曲线Fig.2 DPV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different deposition times deposition time(a-g) :0，3，6，9，12，15，18 min

2.3 扫速与pH值对氧化峰电流的影响

采用循环伏安法研究了电位扫描速率(v)对1.0×10-4mol/L AE在LGN/CFME上电化学行为的影响(图3)。结果表明，扫描速率在50～1 000 mV/s范围内，AE的氧化峰电流(Ip，nA) 随扫速增大而增大，且与扫速(v，mV/s)呈良好的线性关系，其线性方程为：Ip=0.794 2v+256.4，线性相关系数(r2)为0.989 2，表明AE在LGN/CFME上的氧化过程受扩散控制。考虑到扫描速率过快会增大充电电流，从而导致基线噪音变大，因此本实验均在100 mV/s下进行。

分别用不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的Tris-HCl配制1.0×10-4mol/L AE溶液。在100 mV/s扫描速率下，考察了溶液在不同pH值下的循环伏安曲线(图4)及其氧化峰电流与pH值的线性关系。结果表明，在此pH值范围内，AE的氧化峰电位Ep与pH值呈线性关系，其线性方程为Ep(mV)=564.8-26.82 pH,r2=0.955 4，说明AE的电极反应中有质子参与，且AE的氧化峰电位Ep随pH值的增加而负移，说明AE的氧化是脱质子的过程，在高pH值下氧化过程更易发生。而pH 5.0时AE的氧化峰电流最大，这是因为AE在酸性溶液中被还原为蒽酚及其互变异构体蒽酮，在CFME上有较高的电化学活性[16]。因AE在酸性溶液中易被还原，本实验均在pH 7.0下进行。

图3 1.0×10-4 mol/L AE在不同扫速下的CV图Fig.3 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE at different scan rates scan rate (a-g):10,20,50,100,200,500,1 000 mV/s

图4 1.0×10-4 mol/L AE在不同pH值下的CV图Fig.4 CV curves of 1.0×10-4 mol/L AE in different pH values pH value (a-e):5.0,6.0,7.0,8.0,9.0

图5 不同浓度AE在LGN/CFME的差分脉冲图Fig.5 DPV curves of different concentration AE on LGN/CFME AE concentration(a-g):0.02,0.08,0.1,0.2, 0.5,0.8,1.0(×10-4 mol/L)

2.4 工作曲线的测定

在最佳实验条件下，检测了不同浓度AE的DPV响应曲线(见图5)。结果显示，随着AE浓度的增加，其氧化峰电流(Ip，nA)增强，且与AE浓度(C，μmol/L)在2.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，其线性方程为Ip=0.318 1C+25.01，r2=0.965 3，检出限(S/N=3)为6.19×10-7mol/L，说明此方法可用于AE的测定，且具有灵敏度高、线性范围宽的优点。

2.5 干扰实验

在优化实验条件下，考察了一些常见物质对AE测定的影响。当AE浓度为1.0×10-4mol/L，在1.0×10-4mol/L的芦荟多糖和芦荟苷共存下，峰电流改变在±10%以内，且峰电位偏移不超过±0.05 V，表明该修饰电极对AE的检测具有良好的抗干扰能力。

2.6 实际样品的分析

采用该修饰电极对实际芦荟汁样品中的AE含量进行定量分析。采用10 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液将芦荟汁液稀释10倍，以标准加入法对AE进行检测。加入AE的标准溶液浓度分别为5.00、10.00、15.00、20.00、30.00 μmol/L。结果测得加标回收率为95.5%～103%，相对标准偏差(RSD)均小于5.0%(见表1)，表明该修饰电极可实现芦荟汁中AE的定量分析。

表1 芦荟汁中AE含量的测定(n=5)Table 1 Determination results of AE in aloe juice(n=5)

*no detected

3 结 论

本文提出了一种AE的电化学检测方法，通过柠檬酸三钠还原氯金酸制备了线状纳米金，采用一步恒电位沉积的方法在CFME上沉积纳米金，用循环伏安法和差分脉冲法考察了LGN/CFME对AE的电催化氧化性能。该修饰电极对AE有明显的电催化作用，检出限达6.19×10-7mol/L。该检测方法简便、灵敏度高，修饰电极的稳定性和重现性良好，易制备，可用于AE的定量检测。