桑白皮提取物对破骨细胞和成骨细胞活性的影响

郭东贵,俸婷婷,张 敏,王慧娟,*

(1.贵州理工学院食品药品制造工程学院,贵州贵阳 550003;2.贵州中医药大学药学院,贵州贵阳 550025;3.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025)

骨质疏松症是基于骨重建过程中成骨细胞与破骨细胞的协作和平衡被打破,使骨吸收大于骨形成,从而引发骨质疏松的一种骨代谢性疾病[1-2]。基于现代医药研究的发展,从细胞水平上研究成骨细胞与破骨细胞的平衡与协作,探寻抑制破骨细胞吸收和/或促进成骨细胞形成的活性物质,成为开发抗骨质疏松药物和功能性食品的重要途径。

保健类食品在预防和治疗骨质疏松症的过程中发挥着重要作用,因其具有毒副作用小、价廉等优点,近年来受到人们越来越多的研究和关注[3-5],并且,利用中医保健理论,将民族药开发成保健食品用于预防骨质疏松症的研究也逐步深入[6-7]。桑白皮为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮,性甘寒,归肺经,具有泻肺平喘、利水消肿之功效[8]。现代药理研究表明,桑白皮还具有降糖、降脂、抗炎等作用[9-11]。在中医临床与研究中,桑白皮常与其他药材组成复方制剂,用于防治肥胖及糖尿病等引起的骨质疏松[12-14],表明其具有抗骨质疏松的潜力。但目前未见桑白皮单独用于抗骨质疏松方面的研究报道。

本文采用体外细胞模型,研究桑白皮不同提取物对成骨细胞增殖及破骨细胞形成的影响,旨在探讨桑白皮抗骨质疏松的活性作用,为其保健功能的研究及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细胞株MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14) 中国科学院上海细胞库;桑白皮药材 贵州省药材公司;摩鲁新L对照品 实验室自制(经1H-NMR、13C-NMR、MS和HPLC检查,均为单一组分。HPLC归一化法测定,纯度为99.6%);α-MEM液体培养基 HyClone公司;α-MEM干粉培养基 Gibico公司;二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT) 北京Solarbio公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒、1α,25-(OH)2VitD3美国Sigma公司;青链霉素混合液 北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

LEICA DMi8型倒置荧光相差显微镜 徕卡;SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州净化设备有限公司;VARIOSKAN LUX型酶标仪、EVOLUTION 201型紫外-可见分光光度计、LOCATOR JR PLUS型液氮罐、3111型CO2培养箱 Thermo Scientific;YXQ-LS-50SSII型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;BP201S型电子天平 赛多利斯有限公司;LGJ-12型冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑白皮提取物的制备

1.2.1.1 桑白皮水提物 将桑白皮药材粉碎,称取100 g,按照前期实验优化的料液比(1∶10 g/mL)加入蒸馏水,加热至微沸,回流提取3次,合并提取液,过滤,浓缩干燥,即得水提物W。

1.2.1.2 桑白皮醇提物 称取100 g桑白皮粉末,按照前期实验优化的料液比(1∶40 g/mL)加入70%乙醇,65 ℃回流提取3次,合并提取液,过滤,浓缩干燥,即得醇提物E。

1.2.1.3 桑白皮纯化提取物R 按“1.2.1.2”项下方法制备桑白皮醇提液,过滤,浓缩后通过AB-8大孔树脂进一步纯化,收集70%乙醇洗脱液[15],浓缩干燥,即得提取物R。

1.2.1.4 桑白皮纯化提取物PA 将“1.2.1.3”项下经AB-8大孔树脂纯化后的产物,再经聚酰胺柱层析进行分离纯化,收集50%乙醇洗脱液[15],浓缩干燥,即得提取物PA。

1.2.2 桑白皮提取物中总黄酮的含量测定

1.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取摩鲁新L对照品20.3 mg,加乙醇制成每1 mL含摩鲁新L 81.2 μg的对照品溶液。

1.2.2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分别置10 mL量瓶中,各加3% AlCl3溶液0.5 mL,再加乙醇至刻度,摇匀,放置30 min,以不加显色剂的样品溶液为空白,在410 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。

1.2.2.3 样品测定 取桑白皮提取物适量(W和E各0.05 g,R和PA各0.02 g),精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入乙醇50 mL,称定重量,加热回流2 h,放冷,再称定重量,用乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,照“1.2.2.2”项下方法,自“加3% AlCl3溶液0.5 mL”起,依法测定吸光度,同时精密量取供试品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加乙醇至刻度,摇匀,作为空白溶液。通过标准曲线求出供试品溶液中摩鲁新L的含量,并计算样品中总黄酮的含量(以摩鲁新L计)。

1.2.3 实验分组 空白对照组:培养孔中接种与实验组等量的细胞,加入含1‰ DMSO的培养基进行培养。

调零组:培养孔中不接种细胞,只加入含1‰ DMSO的培养基。

实验组:各提取物均设置3个剂量组。W和E:5、10、20 mg/L;R和PA:10、20、50 mg/L。

1.2.4 桑白皮提取物对破骨细胞形成的影响 从出生48 h以内乳兔后肢的股骨和胫骨中获取骨髓细胞悬液,过200目细胞筛,计数后将细胞悬液浓度调整至2×106个/mL,接种于24孔板中培养,每孔500 μL。24 h后吸弃孔内培养液,PBS轻洗1次,然后加入桑白皮提取物W、E、R、PA或空白破骨诱导培养基(α-MEM全培养基中加入10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3)继续培养,以后每隔2 d换一次液。培养8 d后弃培养液,PBS轻洗后进行TRAP染色,具体染色方法参照抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒中所附说明书。染色后置于显微镜下观察,统计各培养孔内的TRAP阳性细胞个数。

1.2.5 桑白皮提取物对成骨细胞活性的影响 将成骨细胞MC3T3-E1 Subclone 14消化,制成单细胞悬液,计数后将细胞悬液浓度调整至5×104cell/mL,接种于96孔培养板中,每孔100 μL。培养24 h后吸弃各孔培养液,更换为新配制的含药α-MEM全培养基或空白α-MEM全培养基(含10% FBS和1%的青-链霉素),置培养箱内继续培养48 h,每孔加入10 μL 5.0 mg/mL MTT溶液,4 h后吸弃孔内液体,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min充分溶解结晶物,于490 nm下测定吸光度值,并计算增殖率。

1.3 数据处理

实验数据以表示,采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,P<0.05表示具有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

结果如图1所示,对照品溶液在8.12～48.72 μg/mL范围内呈良好线性关系:y=0.011x+0.0071(R2=0.9991)。

图1 标准曲线图

2.2 桑白皮提取物中总黄酮的含量

如表1所示,桑白皮醇提物E中总黄酮的含量要高于水提物W。醇提物E经AB-8大孔树脂富集后黄酮含量有所提高,再经聚酰胺柱层析进一步纯化,总黄酮含量可达37.23%。

表1 桑白皮提取物中总黄酮的含量测定结果(n=3)

2.3 桑白皮提取物对破骨细胞的活性作用

破骨细胞作为骨结构中的重要细胞,是一类末端分化的多核细胞,不能增殖传代[16-17]。骨髓细胞经诱导后可分化成破骨细胞,TRAP酶是破骨细胞的特异性标志酶,通过TRAP染色阳性计数,可以反映出破骨细胞的数量[18]。通过研究桑白皮提取物对破骨细胞形成的影响,可提示其抗骨质疏松的活性。

由前期初筛实验结果可知,当提取物W和E剂量达50 mg/L、R和PA剂量达100 mg/L时,培养孔中出现空旷区域,说明药物浓度较高时对骨髓细胞有一定毒性,因此降低剂量进一步研究,结果见表2～表5和图2。

图2 各组破骨细胞的TRAP染色图片(×50)

表2 水提物W对TRAP阳性破骨细胞个数的影响(n=5)

表3 醇提物E对TRAP阳性破骨细胞个数的影响(n=5)

表4 提取物R对TRAP阳性破骨细胞个数的影响(n=5)

表5 提取物PA对TRAP阳性破骨细胞个数的影响(n=5)

由图2可知,各空白对照组破骨细胞数量较多,且破骨细胞体积较大。与空白组相比,桑白皮各提取物高剂量组的TRAP阳性细胞个数显著减少(P<0.01),且破骨细胞体积相对较小。由表2～表5的结果可知,水提物W(20 mg/L)、醇提物E(10、20 mg/L)、纯化提取物R(20、50 mg/L)和纯化提取物PA(10、20、50 mg/L)均能显著或极显著抑制破骨细胞形成(P<0.05或P<0.01)。对于桑白皮粗提物来说,醇提物E抑制破骨细胞作用强于水提物W,而醇提物E的黄酮含量高于水提物W,表明桑白皮粗提物对破骨细胞的活性作用与黄酮含量有关,随黄酮含量增加而增强。桑白皮醇提物进一步纯化后,纯化提取物PA抑制破骨细胞作用明显强于纯化提取物R,活性作用也随黄酮含量增加而增强。

2.4 桑白皮提取物对MC3T3-E1 Subclone 14细胞的活性作用

MC3T3-E1 Subclone 14是从小鼠颅顶骨中分离培养而来的成骨前体细胞,是体外研究成骨细胞常用的细胞模型。本文通过MTT法考察桑白皮提取物对MC3T3-E1 Subclone 14细胞活性的影响,测定结果见表6～表9。

表6 水提物W对MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖的影响

表7 醇提物E对MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖的影响

表8 提取物R对MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖的影响

表9 提取物PA对MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖的影响

研究表明,四种提取物的各剂量组均能促进MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖,与空白组相比,均具有统计学意义(P<0.01)。其中,醇提物E各剂量组增殖率均稍大于同剂量组的水提物W,而纯化提取物R和PA的增殖率又明显大于醇提物E,说明桑白皮醇提物经进一步纯化后对MC3T3-E1 Subclone 14细胞的促增殖作用有所增强。结合“2.2”项下各提取物的黄酮含量测定结果(PA>R>E>W),表明桑白皮不同提取物对成骨细胞的促增殖作用与其黄酮含量有关,活性作用随黄酮含量增加而增强。

3 讨论与结论

破骨细胞和成骨细胞是骨重构过程中的重要组成部分,二者处于生理平衡状态,这种平衡一旦被打破就会引起骨质疏松等骨代谢性疾病[19]。以破骨细胞和成骨细胞作为体外活性筛选模型,是开发抗骨质疏松药物和保健食品的重要途径。

黄酮类物质作为功能性食品的重要活性成分,广泛存在于药用和食用植物中[20]。并且,许多黄酮类物质显示出了较好的骨保护性能和抗骨质疏松特性[21-22]。研究表明,类风湿关节炎、氧化应激、雌激素缺乏都能引起骨质疏松的发生[23-25],而天然黄酮类物质具有抗炎、抗氧化和植物雌激素样作用[26-27],因此黄酮类物质的抗骨质疏松特性与其自身的生物活性密切相关。

本文利用1α,25-(OH)2VitD3诱导兔骨髓细胞建立的破骨细胞实验模型和MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞实验模型,研究桑白皮不同提取物的体外活性作用。研究表明,桑白皮提取物在一定剂量下能够抑制破骨细胞的形成,且对成骨细胞的增殖具有促进作用,表明桑白皮具有调节破骨细胞和成骨细胞平衡协作的潜力。桑白皮中黄酮类化合物含量丰富[28],本文制备了桑白皮的不同提取物并对其黄酮含量进行了测定。结果发现,桑白皮提取物对破骨细胞和成骨细胞的活性作用与黄酮含量有关,随黄酮含量增加而增强,推测黄酮类化合物可能是桑白皮发挥抗骨质疏松活性作用的重要成分,但其作用机制还有待进一步研究和评价。