酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵对果酒品质的影响

谭玉岩,郝 宁

(南京工业大学食品与轻工学院,江苏南京 211816)

果酒是以水果为原料,利用水果表皮的天然酵母或人工添加酿酒酵母发酵酿造而成的具有水果独特香味和营养价值的低酒精浓度饮料。发酵果酒不仅能最大限度的保留水果原有的营养物质,而且同时在发酵过程中通过微生物的代谢增加一些水果不具备的营养物质,从而极大的丰富果酒的营养成分[1]。新鲜水果由于呼吸代谢旺盛、极易受到机械损伤以及腐败微生物的作用相对易腐烂,不利于后期的储藏运输以及营养物质的保存,尤其是一些浆果类水果如蓝莓、杨梅、桑葚、柿子、樱桃、猕猴桃等[2]。因此将新鲜水果酿造成酒精饮料,不仅能极大限度的提升水果的货架期,同时对果农的经济收入也能产生积极的影响。此外,果酒以其营养物质丰富、酒精度低、富含抗氧化成分等优势受到消费者的喜爱。传统的果酒酿造是一个多种微生物共同作用的发酵过程,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是乙醇发酵的主要微生物,而非酿酒酵母(Non-Saccharomycescerevisiae)在产生芳香化合物如酯、高级醇、酸和单萜以及合成多种酶等方面起着重要作用,有助于果酒风味的多样性的形成[3]。发酵过程中酵母物种的种群动态是非常复杂的,主要是由于酵母物种之间的竞争或其他相互作用。

因此本文对混合发酵过程中酿酒酵母和非酿酒酵母之间的相互作用以及对果酒品质的影响进行了综述,以期对后续果酒发酵的研究提供理论基础。

1 果酒酿造过程中的酵母菌

1.1 酿酒酵母

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一种单细胞真核生物,具有生长繁殖快、代谢周期短且副产物少、易培养和分离、能耐受一定浓度乙醇、乙酸和其他抑制剂等特点。在果酒酿造过程中,酿酒酵母将糖转化为酒精,同时产生许多对果酒酒香气有积极作用的副产物,例如酯、高级醇、有机酸以及少量的乙醛[4]。此外酿酒酵母还能产生中链脂肪酸、杀伤毒素和抗菌肽等小分子化合物,能够有效抑制杂菌的生长,防止酒品腐败变质[5-6]。目前果酒酿造过程中,通常直接选用成熟的商业酿酒酵母进行发酵,以保证酒品的稳定性和质量的一致性。研究表明接种纯种酵母菌进行发酵,虽然具有发酵过程易于控制的优点,但是果酒香气淡薄,风味复杂性不够,且口感单一,从而影响果酒潜在的多样性[7-8]。

1.2 非酿酒酵母

非酿酒酵母菌(Non-Saccharomycescerevisiae)是指存在于水果表皮、果园土壤甚至发酵设备上的参与果酒发酵,对果酒品质(口感、色泽、风味、营养物质等)产生重要影响的一类酵母菌的总称。非酿酒酵母能够分泌蛋白酶、果胶酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、纤维素酶等胞外酶,并作用于果汁中的相关底物,产生醇类、酯类、酸类、萜烯类等物质,从而影响果酒的品质与风味。目前常用的主要非酿酒酵母有假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenual)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、克勒克酵母属(Kloeckera)和梅奇酵母属(Metschnikowia)(表1)[9-10]。

表1 葡萄酒生产中常见的非酿酒酵母

2 混合发酵中酵母菌的相互影响

2.1 非酿酒酵母在果酒发酵中的作用

果酒的发酵是在不同的酵母种群共同作用下进行的,早期阶段的特征是某些非酿酒酵母迅速生长繁殖,后期阶段是由酿酒酵母的酒精耐受菌株主导并完成发酵。由于重要代谢物(如甘油、酯和高级醇)的产量增加,一些非酿酒酵母的生长被认为有利于增强葡萄酒香味。然而,这些非酿酒酵母的生长通常限制在发酵前3～4 d,之后便开始死亡,酿酒酵母菌株主导发酵直至完成。果酒酵母种群动态变化一般归因于酿酒酵母能够耐受高浓度乙醇和有机酸,并能应对低pH和营养耗竭等恶劣环境。

非酿酒酵母可以通过产生风味物质直接影响果酒发酵,并通过调节酿酒酵母的生长和代谢间接地影响果酒发酵。在葡萄汁自然发酵过程中,最初细尖酵母(克勒克酵母属/有孢汉逊酵母属)是最丰富的,尽管在3～4 d之后它们被酿酒酵母取代[11]。克勒克酵母属、有孢汉逊酵母属和假丝酵母属的乙醇耐受性较弱,因此它们的生长一般限制在发酵的前几天。然而,在葡萄汁发酵研究中表明,柠檬形克勒克酵母(Kloeckeraapiculata)和星形假丝酵母(Candidastellata)在发酵过程中能够以相当高的水平(高达106～107CFU·mL-1)存活,并且比之前认为的时间更长[9-10]。这些非酿酒酵母在整个发酵过程中的存在和持久性受到若干理化因素和微生物因素的影响。柠檬形克勒克酵母和星形假丝酵母在较低温度(10～15 ℃)下对乙醇的耐受性增加[12]。

研究表明非酿酒酵母在葡萄酒酒体形成中起着积极作用[13]。一些非酵母菌种类可以改善酿酒酵母的发酵行为和葡萄酒的组成成分,或形成更加复杂的香气。据报道美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)已被证明与酿酒酵母共培养具有协同作用,并促进许多芳香化合物的产生,包括脂肪酸、酯和萜烯醇[14]。Lachanceathermotolerans和假丝酵母菌(Candidazemplinina)能够降低葡萄酒的pH同时增加2-苯乙醇和甘油的含量,有孢汉逊酵母属能够产生水果醋酸酯[15],这些成分有助于果酒风味的形成。在与酿酒酵母的混合发酵中,与酿酒酵母的纯培养物相比,戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)能够促进许多化合物的释放,增强葡萄酒的复杂性和果香味,这种现象似乎与特定乙酯的增强有关[16]。

此外,非酿酒酵母可以通过酶活性来影响果酒的品质特征。在混合发酵过程中非酿酒酵母能够产生高活性的聚半乳糖醛酸酶和β-D-木糖苷酶,可用于提高果酒质量[17]。β-葡糖苷酶是另外一种与非酿酒酵母密切相关的生物催化活性物质,它能够水解萜烯基糖苷,增强葡萄酒的香气。与葡萄糖苷酶相反,酵母产生的β-葡糖苷酶不受葡萄糖的抑制,并且它参与发酵过程中萜烯醇的释放。这种β-葡萄糖苷酶活性已经在与葡萄酒酿造相关的几种酵母物种中发现,特别是在非酿酒物种中[18]。非酿酒酵母产生的糖苷酶和碳-硫裂解酶可催化挥发性化合物从非挥发性前体如萜烯醇或挥发性硫醇中释放[19]。Moreira等[20]研究了季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniasporaguilliermondii)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)在单一和混合条件下与酿酒酵母混合发酵过程中能够产生重硫化合物、高级醇和酯,而不增加的重硫化合物。因此可以根据非酿酒酵母产生有利代谢产物的能力来选择发酵菌株,这些代谢产物有助于确定最终的果酒风味。

2.2 混合发酵过程中酵母菌细胞之间相互作用的影响

在混合发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母之间进行着生理和代谢之间的相互作用。研究表明酵母菌不同物种细胞间的相互接触能够对细胞的生长代谢产生影响。Nissen等[21]提出酵母菌可以通过细胞与细胞间的物理接触对细胞的生长产生影响,尽管可能涉及到诸如不同酵母物种葡萄糖摄取能力、氧气可用性等其他机制,并提出非酿酒酵母的早期死亡可能取决于与其紧密接触的活酿酒酵母的数量。Renault等[22]设计了一种双室发酵罐来研究酿酒酵母与戴尔凯氏有孢圆酵母混合发酵过程中的相互作用,结果表明酿酒酵母通过直接的物理接触或非常接近的方式诱导了戴尔凯氏有孢圆酵母的细胞死亡,证实了细胞与细胞接触机制的存在。在混合发酵中,柠檬形克勒克酵母的絮凝菌株与酿酒酵母的非絮凝菌株相互作用,诱导这两种酵母的共絮凝[23]。此外,酿酒酵母和其他物种之间的群体感应现象以及细胞间接触的介导机制也是诱导非酿酒酵母早期死亡的因素[22]。最近,酵母中的群体感应现象被研究以解释混合发酵过程中细胞形态从丝状到菌丝体或酵母形态的转变[24]。

2.3 混合发酵过程中代谢产物对酵母菌的影响

Mendoza等[25]发现在混合发酵过程中,酿酒酵母和非酿酒酵母的生物量均低于纯培养条件下两种菌株的生物量。然而,混菌发酵促进了发酵过程中非酵母的持续增加[25-26]。实际上,酿酒酵母和非酿酒酵母之间的相互作用不仅影响非酿酒酵母的持久性,而且影响酿酒酵母菌株的生长代谢行为。通过混合培养细戴尔凯氏有孢圆酵母、克鲁维耐热酵母(K.thermotolerans)以及酿酒酵母评估细胞间相互接触的影响,表明这些非酿酒酵母与酿酒酵母相比竞争空间的能力较弱。酿酒酵母的代谢物如乙醇、中链脂肪酸、杀伤毒素和抗菌肽也被认为可以解释这种相互作用[27]。

混合发酵的代谢图谱(图1)显示非酿酒酵母与酿酒酵母之间的相互作用,与单菌株发酵相比的有很大差异[28]。King等[29]使用不同酿酒酵母纯种发酵等量单品系葡萄酒,得到的产品化学成分和感官特性之间也有所差异。在酿酒酵母和非酿酒酵母混合培养中,由于存在广泛的属间代谢多样性,因此相互作用应该更高。在酿酒酵母和球拟假丝酵母(Starmerellabombicola)相互作用下,观察到葡萄糖和果糖的补充消耗[30]。利用连续发酵和固定化酵母细胞,发现了乙醛在这两种酵母物种之间的交换。由于乙醇脱氢酶的活性较低,球拟假丝酵母产生的过量乙醛被酿酒酵母快速代谢[31]。此外,Ciani等[31]报道了酿酒酵母和贝酵母(Saccharomycesbayanus)混合发酵过程中乙醛被消除的机制。在使用酿酒酵母、细戴尔凯氏有孢圆酵母和克鲁维耐热酵母的混合发酵中也发现了乙醛产生(还原)中的这些相互作用。参与混合发酵中两种酵母之间相互作用的化合物还有乙偶姻,这主要由球拟假丝酵母在纯培养物中产生,并且在混合发酵中由酿酒酵母完全代谢。

图1 酵母菌单一培养与混合培养的代谢图谱

Garde-Cerd’an等[32]报道了野生酵母和酿酒酵母混合发酵挥发性化合物的积极的相互作用,研究表明与纯发酵相比混合发酵酯浓度有所提高。野生酵母在发酵过程中2-甲基丙醇、2-甲基丁酸、2-甲基丙酸乙酯、癸酸乙酯和十二烷酸乙酯含量有所增加。Moreira等[20]比较了葡萄汁有孢汉逊酵母的纯种和混合发酵,与纯种发酵相比,混合发酵中酯产量的增加而乙酸乙酯产量的降低。通过使用具有低水平乙酸乙酯(低活性的乙酸乙酯水解酯酶)的异常毕赤酵母(Pichiaanomala)突变体进行研究,发现乙酸乙酯的存在减少决定了异常毕赤酵母突变体和酿酒酵母之间的相互作用[33]。通过该菌株产生乙酸乙酯导致酿酒酵母中乙酸酯水解酯酶活性的增加。因此,在混合培养代谢产物中积累了所需量的异戊酸乙酯但是乙酸乙酯并未过量。硫醇的产生也显示了混合发酵中的酿酒酵母与非酿酒酵母之间的积极的相互作用。与纯培养物相比,克鲁维酵母和酿酒酵母的混合发酵导致3-巯基己基乙酸酯增加,这种相互作用似乎处于应变水平,而不是物种水平,但相互作用的性质仍然未知。

表2总结了混合发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母之间的相互作用。

表2 混合发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母之间的相互作用

3 混菌发酵对果酒品质的影响

3.1 不同的发酵接种方式对果酒品质的影响

关于使用所选酵母菌株进行自发和接种发酵,特别是在最终葡萄酒的感官质量方面存在争议。在自然发酵的情况下,不同种类的酵母对葡萄酒香气和风味的影响可能缺乏一致性,同时发酵是一个不受控制的过程。另一方面,完全抑制非酵母的活性最终影响果酒香气的复杂度。实际上,一株优良的酿酒酵母菌株不仅可以抑制潜在的腐败酵母,还可以抑制非酿酒酵母的生长代谢。然而,自然的多阶段培养仍然是一个不受控制的过程,多阶段培养需要在更明确的条件下使用。同样,在开发新的发酵技术时,需要监测不同酵母发酵剂种类的组合或连续使用情况。由于某些与酿酒有关的非酿酒酵母具有特殊的代谢特性,长期以来被认为是发酵剂。因此,通过限制或延迟所选酿酒酵母的使用来促进非酿酒酵母在酿酒中的活动是可能的。

采用多阶段发酵即通过控制接种顺序及物料添加方式能够有效地控制混合发酵进程提高发酵效率。Moreno等[34]研究了使用多阶段连续发酵降低挥发性酸度和增强葡萄酒的感官特征。Bely等[35]评估了混合和连续接种戴尔凯氏有孢圆酵母在高糖发酵培养基中,以确定它是否能提高葡萄酒的质量和降低乙酸含量,以20∶1的比例混合戴尔凯氏有孢圆酵母和酿酒酵母，可分别降低53%和60%的挥发性酸和乙醛,而连续培养对这些代谢物的降低效果较低。混合培养对于葡果酒的生物脱酸有重要作用,使用酿酒酵母和固定化的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)细胞获得更受控制的生物脱酸过程[36]。在该过程中,酿酒酵母使用几乎所有可用的糖进行发酵,而固定的粟酒裂殖酵母细胞使用苹果酸。在这些条件下,粟酒裂殖酵母对葡萄酒质量的不良影响受到限制或消除。Silva等[37]提出使用葡萄酒酿造中苹果酸消耗的干燥固定化粟酒裂殖酵母细胞以及来自粟酒裂殖酵母的商业酵母菌株现在可以以固定化形式降低葡萄酒中的苹果酸含量。此外,东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)可以快速降解苹果酸[38]。由于克鲁维耐热酵母在发酵过程中显示出一些优良特性,例如挥发性酸度的低产量和固定酸度的高产量[L(+)乳酸形式],在和酿酒酵母的混合发酵过程中,可使可滴定酸度增加70%,降低0.3 pH单位,从而实现生物降酸。

Kapsopoulou等[39]还提出了使用多级发酵过程来模拟自然发酵过程,以赋予葡萄酒更大的复杂性。研究发现混合和连续培养对所得葡萄酒的挥发性成分有所影响,酿酒酵母的代谢也存在明显差异[40]。研究表明,在与酿酒酵母混合发酵过程中,季也蒙有孢汉逊酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母对硫化合物、高级醇和酯的生成对理想化合物的生成有增强作用。值得注意的是在混合发酵中,葡萄汁有孢汉逊酵母提高了葡萄酒中的乙酸异戊酯含量,而季也蒙有孢汉逊酵母提高了2-苯乙基乙酸酯的含量。

在发酵过程中,星状假丝酵母菌株被用作固定形式的生物催化剂。通过固定化的星状假丝酵母细胞和酿酒酵母的组合进行的发酵从而改善了所得葡萄酒的成分。这些结果也在中试规模的酿酒过程中得到证实。在霞多丽葡萄酒的生产中,利用一株星状假丝酵母菌株与酿酒酵母混合发酵进行了分析,将同时接种和连续接种与两种酵母的纯种发酵相比较,侧重在感官分析,结果表明,与纯种发酵相比,不同葡萄酒的某些积极和消极的特性在多阶段发酵中有所增加[41]。假丝酵母(Candidacantarellii)是葡萄酒环境中的另一种发酵物种,也被提出用于多级发酵,以增强甘油和开发具有特殊特征的葡萄酒。还提出了混合发酵以增强特定的挥发性化合物以改善葡萄酒的香气。Anfang[13]提出用酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)混合发酵以增加长相思中硫醇浓度。研究表明,酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母按1∶9的启动率可提高了长相思中3-巯基己基乙酸盐的浓度。非酿酒酵母具有一些特定的酿酒特征,这些特征在酿酒酵母菌种中不存在并且可以对葡萄酒具有累加效应。酿酒酵母和非酿酒酵母的受控混合培养可通过酵母物种之间的代谢相互作用改善葡萄酒的成分和芳香特征。在此情况下,在混合培养中使用固定化技术可对多阶段发酵过程进行严密监控。表2总结了混合发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母之间的相互作用。

3.2 混合发酵对果酒抗氧化活性的影响

在果酒发酵过程中酚类化合物能够与酵母菌产生的甘露糖蛋白相互作用,甘露糖蛋白可通过弱化和可逆的相互作用减少葡萄酒的总多酚含量[42]。为了证明酵母菌的选择对葡萄酒酚类化合物的影响,已经进行了许多研究。Escot等[43]通过研究单宁与不同酵母释放的甘露蛋白之间的相互作用,发现添加特定酵母的甘露蛋白会导致更多的单宁缩合,同时降低葡萄酒的涩味。此外酵母菌的代谢产物,如丙酮酸、乙醛,能与不同种类的酚类化合物反应,从而影响果酒中总酚含量[44]。研究表明,果酒发酵酵母能对果酒中的酚类化合物的浓度和组成产生影响[45],通常通过将酚类化合物吸附在细胞壁上来降低其含量。据报道果酒发酵酵母与果酒中的酚类化合物之间呈现显著相关性,表明菌株的行为可以改变果酒的色度、酚类物质和抗氧化能力[46]。水果种类及品种与果酒酵母之间的相互作用是十分密切且重要的,同时不同水果中的酚类成分也会调节酵母菌株的吸附活性[45]。

3.3 混合发酵对果酒色素的影响

构成果酒颜色的主要色素物质为花青素及其衍化产物,但花青素性质不稳定,易受温度、光照、氧气、金属离子、pH、花青素浓度、游离二氧化硫、小分子酚类物质以及代谢产物等的影响,因此护色也是选择酵母菌进行发酵的标准之一。

在酿酒过程中,由于酵母菌的细胞壁能够去除大量的色素,而发酵过程中释放甘露蛋白和不同的多糖又能够抵抗色素物质的降解从而阻止果酒褐变。因此选择合适的酵母菌进行发酵对果酒颜色以及品质有着重要的影响。发酵过程中酵母菌通过产生花青素-β-D-葡萄糖苷酶、丙酮酸和乙醛与花色苷相互作用,增加色素的稳定性。研究表明采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵,能够有效促进葡萄糖苷特定前体物(如丙酮酸和乙醛)的产量增加,因此能够提高了稳定色素葡萄糖苷的合成[46]。此外,混合发酵过程中一些能够促进葡萄糖蛋白前体的或羟基肉桂酸脱羧酶活性的释放非酿酒酵母的添加,也可以增加稳定色素的合成。Benito等[47]发现季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondii)因具有较高的羟基肉桂酸脱羧酶活性,能够增加乙烯基苯酚类吡喃花青素的形成,可改变不同pH下葡萄酒颜色的稳定性。Morata等[48]研究发现裂殖酵母不仅能够产生高于酿酒酵母产量的丙酮酸还具有较高的羟基肉桂酸脱羧酶活性,对保护果酒的颜色具有十分重要的价值。

4 结语及展望

目前,采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵来提高果酒品质已得到广泛应用。然而混合发酵的研究大多侧重于对不同水果原料对酒体风味成分的影响以及不同接种方式对果酒品质的影响,对果酒酿造过程中酿酒酵母和非酿酒酵母之间代谢相互作用的了解是有限的。此外,很少有研究对混合发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母相互作用的分子机制进行深入研究。随着科技水平的进步,组学方法(基因组学、蛋白质组学、代谢组学)的应用有助于研究者从分子水平对混合发酵过程中酵母菌的相互作用进行研究。