白细胞介素8对宫颈癌细胞增殖和侵袭转移的影响及其机制*

兰 蕙 黄 婷 韩垠超 王琳琳 叶丽平，2

（锦州医科大学，1 基础医学院病理学生理学教研室，2 生物人类学研究所，锦州 121000）

宫颈癌是威胁全世界女性健康及生命的主要恶 性肿瘤之一，目前其发病率占女性恶性肿瘤第4位[1]，宫颈癌的侵袭转移是患者死亡的重要原因。白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和血液恶性肿瘤等多种肿瘤的起始和发展中起着不可忽视的作用[2]。PI3K/AKT 信号通路是目前诱导上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition）的关键因素之一，促进EMT 间质性标记物波形蛋白（vimentin）、β-连环蛋白（β-catenin）表达增加，上皮性标记物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少。IL-8 能否通过PI3K/AKT 信号转导通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移能力，尚未见相关报道。本研究拟从细胞分子水平探讨IL-8 促进宫颈癌细胞增殖和迁移的作用机制，为阐明宫颈癌的转移机制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料及分组

宫颈癌细胞株Caski（购于中国科学院上海细胞库）；1640 培养基（美国Gibco 公司）；胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；LY294002（美国APEXBIO 公司）；Matrigel 基底胶（BD 公司）；Transwell 小室（康宁生物技术有限公司）；IL-8、抗磷酸化和非磷酸化 AKT 抗体、兔抗人 E-cadherin、兔抗人β-catenin 抗体、鼠抗人vimentin 抗体（博奥森生物技术有限公司）；MTT 液（Solarbio 公司）；胎牛血清（美国CLARK Bioscience 公司）BCA 蛋白定量试剂盒（美国SAB 生物科技有限公司）；二甲基亚砜（美国Sigma 公司）。根据IL-8 不同浓度分为对照组 、IL-8 组（20、40、60、80、100 ng/mL）、IL-8+LY294002 组（80 ng/mL IL-8 +20 µmol/L LY294002）和LY294002 组（20 µmol/L）。实验重复3 次。

1.2 MTT 法检测细胞的增殖能力

对数生长期的细胞调整细胞浓度为2×105/mL，接种于96 孔平底板且每孔加入100 μL，边缘孔用无菌PBS 填充。培养箱中培养至细胞单层铺满孔底后按照不同的浓度梯度加药，每个浓度设5 个复孔。放置CO2 培养箱中培养24 h 后每孔加入20 μL MTT 溶液，4h 后终止培养。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm 处测量各孔的吸光值。

细胞增殖率=（实验组OD 值/对照组OD 值）×100%

1.3 划痕实验检测细胞的侵袭能力

用记号笔在6 孔板背后约每间隔1 cm 均匀划横线，每孔穿过5 条线。将培养至对数生长期的细胞制成细胞悬液，每孔加入1×106个浓度的细胞，待细胞长至80%，用枪头划线（尽量垂直于背后的横线）。PBS 清洗3 遍，以便去除漂浮的细胞。拍照记录0、24 h 划痕宽度的变化，用Image J 软件计算愈合率。划痕愈合率=（原始宽度-24 h 后宽度）×100%/原始宽度

1.4 Transwell 检测细胞的迁移能力

Matrigel 胶与1640培养液按1：9稀释后，50 μL 加入各上室，孵育3 h。将对数生长期细胞浓度调整为1.0×105/mL，接种于上室，12 h 后按照实验分组加药，孵育箱培养24 h，转入含4%福尔马林的下室固定15 min，苏木精染色20 min 后，显微镜下对5 个不同视野中穿过膜的细胞计数，进行统计分析，每组设置3 个复孔，实验重复3 次。

1.5 免疫印迹检测

待细胞融合至80%后，于冰上刮下细胞，离心弃上清。加入蛋白裂解液冰上裂解30 min 后于4℃、12 000 r/min，离心20 min，取上清。BSA 法测定蛋白浓度。制备10%分离胶和5%浓缩胶。300 伏恒定电压电泳至溴酚蓝指示剂到达胶底部时终止电泳，15 伏恒定电压转膜20 min。取出PVDF 膜放入5%的脱脂奶粉中封闭2 h 后，TBST 清洗2 次，分别加入兔抗人E-cadherin 抗体（浓度为1∶1000）、兔抗人β-catenin 抗体（浓度为1∶1000）、鼠抗人vimentin 抗体（浓度为1∶1000），4℃摇床过夜。用TBST 清洗3 次，每次10 min，加入相应的稀释二抗，室温摇床1.5 h。化学凝胶成像发光仪扫描。

2 结果

2.1 IL-8 对细胞增殖的影响

IL-8 对宫颈癌细胞的增殖呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.01），但80 ng/mL 和100 ng/mL 组之间差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。IL-8+LY294002 组及LY294002 组细胞的增殖率低于IL-8 组（80ng/mL）差异均有统计学意义（P＜ 0.01）（表1）。

表1 IL-8 对Caski 细胞增殖的影响（n=6，±s）Tab1 Effect of IL-8 on proliferation of Caski cells（n=6，±s）

表1 IL-8 对Caski 细胞增殖的影响（n=6，±s）Tab1 Effect of IL-8 on proliferation of Caski cells（n=6，±s）

**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs IL-8 group

Group Cell proliferation rate（%）Absorbency value Control 0 0.182±0.008 IL-8（20 ng/mL）138.52 0.252±0.180**IL-8（40 ng/mL）194.09 0.352±0.012**IL-8（60 ng/mL）226.87 0.412±0.230**IL-8（80 ng/mL）283.79 0.516±0.024**IL-8（100 ng/mL）271.35 0.492±0.017 IL-8+LY294002 207.84 0.378±0.062△△LY29400 63.53 0.120±0.010△△

2.2 IL-8 对细胞侵袭能力的影响

与对照组（12.84%±2.16%）相比，加入IL-8（80 ng/mL），侵袭能力明显增强（67.33%± 3.27%），差异有统计学意义（P＜0.01）。IL-8+LY294002 组（44.54%±2.04%）及LY294002组（9.07%±1.32%）侵袭能力低于IL-8（80 ng/mL）组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1）

2.3 IL-8 对细胞迁移的影响

IL-8（80 ng/mL）组穿透的细胞数高于对照组。而IL-8+LY294002 组穿透细胞的数低于IL-8 组（80 ng/mL），LY294002 组穿透细胞的数低于对照组（图2）。

图1 划痕实验0 h（A1～D1）、24 h（A2～D2）细胞侵袭情况，普通显微镜，×200 Fig1 Cell invasion in the scratch test at 0 h（A1-D1）and 24 h（A2-D2），normal microscopy，×200

2.4 IL-8 对AKT、vimentin、β-catenin、E-cadherin蛋白表达的影响

IL-8 组（80 ng/mL）与对照组相比，β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表达量增加，E-cadherin 蛋白表达量减少（P＜0.01）。与IL-8 组（80 ng/mL）相比，IL-8+LY294002 后β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表达量明显降低，E-cadherin 蛋白表达量增加（P＜0.01）。与对照组相比，LY294002 组β-catenin、vimentin、p-AKT 蛋白表达量明显降低，E-cadherin蛋白表达量明显增加（P＜0.01）（图3）

图3 IL-8 和LY294002 对细胞t-AKT 、p-AKT、vimentin、β-catenin、E-cadherin 蛋白表达的影响Fig3 Effect of IL-8 and LY294002 on the expression of t-AKT，p-AKT，vimentin，β-catenin，E-cadherin protein in cells

3 讨论

IL-8与2个特异性7跨膜G蛋白偶联受体即CXCR-1和CXCR-2结合后通过JAK2/STAT3/Snail[3]途径和PI3K/AKT信号转导通路诱导肿瘤细胞上皮间充质转化[4-5]，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。在组织水平上，IL-8在宫颈癌组织的表达量明显高于正常宫颈组织[6]。目前，IL-8促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭转移是否与PI3K/AKT信号通路有关并不十分清楚。

上皮细胞中AKT 水平激活能够减少细胞间黏附力，减少细胞极性并且诱导细胞运动，改变上皮 细胞和间质细胞标志物的表达和分布，参与肿瘤细胞的EMT，进而促进肿瘤细胞发生侵袭转移[7]。而vimentin 作为EMT 的间质细胞标志蛋白在发生EMT 时表达量增加，其表达还与宫颈癌的淋巴结转移和临床分期密切相关，患者5年生存率显示，vimentin 蛋白高表达的宫颈癌患者预后最差，阴性表达的患者预后较好[8]。在正常细胞中[9]，β-catenin大部分位于细胞膜上，参与E-cadherin/β-catenin 复合体的形成，维持细胞间的黏附作用。在发生肿瘤的情况下[10]，Wnt 信号通路被激活，切断β-catenin的降解途径，使β-catenin 在细胞内蓄积并向细胞核内转位，与细胞核内的T 细胞因子淋巴样增强因子相互作用，结合形成复合体，调控下游基因cyclinD1、C-myc、Snail 等的表达，导致细胞发生EMT，促进肿瘤的转移[11]，使vimentin 表达增加，上皮细胞标志物E-cadherin 表达减少。

本研究结果显示与对照组相比，在IL-8 作用下宫颈癌细胞的增殖速度和迁移速度均加快，侵袭能力增强。IL-8 作用下P-AKT、vimentin、β-catenin蛋白表达上调，E-cadherin 蛋白表达下降，但AKT总蛋白表达量不变，使用PI3K/AKT 信号通路抑制剂LY294002 后IL-8 的上述作用被阻断。

综上所述，该实验中外源性IL-8 可能通过促进AKT 磷酸化，激活了PI3K/AKT 通路，从而使宫颈癌细胞发生EMT，促进宫颈癌细胞发生迁移及侵袭。当应用抑制剂LY294002 后，上皮细胞标志物E-cadherin 蛋白的表达增加而间质细胞标志物vimentin 和β-catenin 蛋白的表达减少，进一步说明PI3K/AKT 信号通路在IL-8 促进宫颈癌迁移及侵袭中发挥着重要作用。本研究初步探讨了IL-8 对宫颈癌细胞致癌潜能的影响及部分作用机制，为临床诊断治疗宫颈癌提供新的靶点，以期更深入探讨IL-8在宫颈癌中的作用机制。