一株海洋蛭弧菌的裂解谱和盐度耐受性分析

近年来，由弧菌导致的水产动物病害频繁发生，弧菌病害已成为海水养殖病害最重要的防治对象之一。蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，由于它具有寄生和裂解许多鱼类和水体致病性细菌的作用，在生物预防弧菌方面日益显出其优越性。水产用噬菌蛭弧菌优良菌种的筛选获得是其后续研究开发与应用的重要保障，基于此，本实验对本实验室保存的一株海洋蛭弧菌BD-zr-11(分离自海水养殖池)进行了裂解谱分析和盐度耐受性分析，旨在为该菌株在海水养殖中的潜在应用提供一定科学依据和数据支撑。

一、材料与方法

1.实验材料

(1)海洋蛭弧菌BD-zr-11为本实验室保存，分离自海水养殖池。

(2)宿主菌株共7株，分别为嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、鳗弧菌以及金黄色葡萄球菌，均为实验室保存，分离自南美白对虾肝胰腺、肠道或不同养殖环境水样。

(3)营养肉汤、琼脂购自国药集团化学试剂有限公司。

(4)仪器设备：震荡培养箱(HZQ-F160)、高速冷冻离心机(TGL-20bR)和细菌浊度仪(WGZ-XT)。

2.实验方法

(1)裂解谱测定。将上述7种宿主菌分别接种于50毫升灭菌营养肉汤液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中培养18小时，转速为120转/分；4℃、5000转/分条件下离心30分钟，收集菌体；用无菌生理盐水洗涤两次，离心收集菌体后用生理盐水重新悬浮，细菌浊度仪测定比浊度，调整终浓度为1×1012CFU/毫升。将制备好的宿主菌菌悬液置于4℃冰箱中保存备用。采用双层琼脂平板法对公司蛭弧菌产品进行裂解谱分析，双层琼脂平板培养基下层为1.2%琼脂、上层为0.8%琼脂，每个细菌做3个平板，记录噬菌斑出斑时间及噬菌斑数量。根据形成的噬菌斑数量判断蛭弧菌对宿主菌侵染裂解作用。噬菌斑形成数量越多，表明蛭弧菌对某一宿主的侵染裂解效率越强。

(2)盐度耐受性分析。参照程俊茗等人的方法，我们选择0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%共7个盐度梯度进行试验，采用双层琼脂平板培养法，根据形成噬菌斑数量判断蛭弧菌对盐度的耐受性，并测定其最佳生长盐度。

二、结果

1.裂解谱分析

由图1可知，7种宿主菌中，蛭弧菌BD-zr-11对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌虽然没有表现出噬菌能力，但是对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌以及大肠杆菌这5种致病菌均具有良好的裂解能力，且表现为对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的裂解能力较对其他3株弧菌强。这与WILLIAMS HN、PINEIRO SA、RICE TD等人的研究报道一致。5株敏感菌均从48小时后开始出现噬菌斑，首先表现为点状，随着时间延长，噬菌斑逐渐扩大。

图1 蛭弧菌BD-zr-11形成的噬菌斑

2.盐度耐受性分析结果

由图2结果可知，盐度对蛭弧菌的生长有明显的影响。蛭弧菌菌株对盐度的耐受范围是5～35，盐度较低时，蛭弧菌的生长不良，蛭弧菌在盐度15～35的范围内生长状况良好，最适生长盐度为25，数量级为104，是一株广盐性菌株。

图2 不同盐度对蛭弧菌BD-zr-11生长的影响

三、讨论

由于渗透压的关系，根据不同的养殖环境投放不同来源(海水或淡水)的蛭弧菌，才能保证最大限度地发挥蛭弧菌的效价。本实验所用蛭弧菌BD-zr-11不仅对海洋致病菌副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌有裂解能力，对淡水致病菌嗜水气单胞菌和大肠杆菌也有较好的裂解能力，具有一定的潜在开发利用前景，但在实际应用中，其裂解能力可能会受到温度、盐度、环境污染物等多方面的影响。虽然该株蛭弧菌对盐度耐受性较广，但在盐度为5及更低盐度下，蛭弧菌的生长、繁殖受到抑制，导致其在淡水养殖上应用受限。

另外，本文所选水产养殖常见致病菌种类有限，其噬菌范围有待进一步的扩展验证。该株蛭弧菌的实验室应用效果、对有益菌有无杀灭效果，在不同养殖品种、不同水质条件、不同使用浓度下的临床应用研究有待进一步验证。