10 种复方中草药对鲟源海豚链球菌体外抑菌实验的研究

袁国尚 张安青 姚 丽 何柯微 吴洪臣 姜海波,4 文 明 邵 俭 唐 黎,4

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学特种水产研究所，贵州 贵阳 550025；3.铜仁市农业农村局渔业技术推广站，贵州 铜仁 554300；4.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；5.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)

我国是鲟鱼养殖量最大的国家，也是鲟鱼种类分布较多的国家，鲟鱼具有极高的经济价值和科研价值，然而一直以来疾病是威胁众多养殖户的一个重大问题。细菌性疾病在我国鱼类的养殖中尤为普遍与常见，广大的养殖户都在使用抗生素类药物进行治疗，过多和长期性地使用抗生素类药物不仅会加剧养殖水环境的破坏，还会使病原菌产生耐药性，不利于病害的治疗。因此，寻找能替代抗生素且不会污染养殖水域环境的药物成为水产养殖的一个重要研究方向。中草药不仅具有一定的抗菌效果，而且还具有来源广泛、毒副作用小、残留少、污染小等优点，成了替代抗生素的优选。

海豚链球菌为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然水体、土壤以及食物当中。海豚链球菌对鱼类感染力强，易造成巨大的经济损失。据相关的研究，藿香、豨莶草、槐角、博落回、紫草、田基黄、补骨脂、三颗针、田七须和五倍子等中草药对海豚链球菌均有不同程度的抑制效果。中草药可直接作用于病原菌的细胞壁，抑制病原菌细胞壁的形成，影响或破坏其生长、繁殖和代谢从而达到杀灭细菌的目的。因此，本研究选取了小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散等10味复方中草药，研究其对鲟源海豚链球菌的体外抑菌作用，为使用中草药预防和治疗海豚链球菌疾病提供一定的理论依据。

一、材料与方法

1.实验菌株 鲟源海豚链球菌为北京市水产技术推广站提供。

2.实验药物 选取小柴胡汤、芍药汤、玉屏风散、痛泄要方、黄连解毒汤、升麻葛根汤、茵陈蒿汤、小青龙汤、大承气汤和猪苓汤10种具有消炎抗菌等功效的复方中草药为研究对象，实验前将10种复方中的全部单味中草药分别粉碎后过60目筛，干燥保存备用。

3.中草药复方组合及药液制备 根据《方剂学》按照比例组合成10种复方中草药(表1)，用水提法制备所需的药液，即称取所需中草药粉末置于纱布之中，保证药物不能漏出纱布；取陶制罐，将药包置于陶制罐中，加入超出药物表面5厘米的蒸馏水，浸泡1小时；武火沸腾后转文火，30分钟后取药液，重复3次，后将所有药液混合浓缩，使其终浓度为1000毫克/毫升，离心后，取上清液121℃高压灭菌，4℃保存备用。

表1 复方中草药组合

4.菌悬液的制备 取保藏菌种，接种在固体培养基中，28℃培养24小时。挑取单菌落于TSB液体试管中进行摇床培养24小时(28℃，140转/分)，调整菌液浓度为2×108～3×108CFU/毫升，用于后续实验。

5.中药平板抑菌实验 本实验采用牛津杯法，即使用直径为9厘米的培养皿，将培养皿平均内分为3个区域，然后在3个区域中央固定位置放置一个高为(10±0.1)毫米、外径为(8±0.1)毫米、内径为(6±0.1)毫米的牛津杯，使其成为正三角形的结构，并且牛津杯两两之间的距离不得小于3厘米，避免抑菌圈的重叠进而影响抑菌圈的测定。待灭菌的培养基冷却至50℃时均匀倒入培养皿，待其凝固后取出牛津杯，做好标记。各培养皿加入100微升的菌液，后用无菌棒涂抹均匀，在培养皿相应孔中分别加入100微升药液。每种药液需要设3个平行组，设置阳性对照(涂菌、打孔、加强力霉素)和空白对照(涂菌、打孔、加双蒸馏水)，将培养皿放置于28℃恒温培养箱中培养24小时后，用游标卡尺精准测量抑菌直径。每孔取不同方向测量两次，最终求取3个平板共6次测量结果的平均值，以代表该种药液抑菌效果。判断标准：抑菌圈直径＜10毫米为低度敏感(-)，10～20毫米为中度敏感(＋)，＞20毫米为高度感(＋＋)。

6.最小抑菌浓度 采用二倍稀释法测定各组药的最小抑菌浓度(MIC)，即在无菌环境下，首先取13只带有棉塞的试管(15毫米×150毫米)，然后对试管进行1～13编号。在编号为1～11的试管中加入2.5毫升的液体培养基，后在1号试管中加入2.5毫升的原药液，然后从1号试管中吸取2.5毫升的混合液到2号试管，再从2号试管中取2.5毫升的混合液到3号试管，依次吸取2.5毫升到11号试管，后再从11号试管中吸取2.5毫升丢弃。最后在1～11号试管中各加入100微升菌液，摇匀，12号试管中加菌液不加药液作为生长对照组，13号试管号中加药液不加菌液作空白对照。每种中草药重复3次，最后放置28℃的震荡培养箱中培养24小时；培养结束后观察1～13号试管内的细菌生长情况，其中无菌生长的最高稀释浓度即为MIC。

7.最小杀菌浓度 在MIC实验基础上继续培养24小时，观察结果，清澈透明无混浊现象的试管即为无菌生长试管。无菌生长试管中的最低药物质量浓度为最小杀菌质量浓度(MBC)。

8.数据处理 采用SPSS 16.0对所得数据进行统计分析，结果以(平均值±标准差)表示。

二、结果

1.复方中草药水提物的抑菌圈测定 10种复方中草药对海豚链球菌的抑制效果见表2，从表中我们可以看到鲟源海豚链球菌对小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散呈现为高度敏感，其抑菌直径分别为(25.34±0.37)、(24.52±1.03)、(23.26±0.41)毫米；鲟源海豚链球菌对痛泄要方、黄连解毒汤、茵陈蒿汤和升麻葛根汤呈现为中度敏感，其抑菌直径分别为(17.45±0.83)、(15.75±0.57)、(14.89±2.18)、(14.49±1.07)毫米，鲟源海豚链球菌对小青龙汤、大承气汤和猪苓汤呈现为低度敏感。

表2 复方中草药水提物对海豚链球菌的体外抑菌活性

2.复方中草药的MIC和MBC 复方中草药对于鲟源海豚链球菌的MIC和MBC见表3。实验结果表明，芍药汤的MIC和MBC最明显，分别为31.25毫克/毫升和62.5毫克/毫升。其次为小柴胡汤，其MIC和MBC分别为31.25毫克/毫升和125毫克/毫升。而玉屏风散的MIC和MBC为62.5毫克/毫升和125毫克/毫升。黄连解毒汤、茵陈蒿汤、痛泄要方和升麻葛根汤的MIC分别为125、125、125、125毫克/毫升，其 MBC分别为 250、500、500、500毫克/毫升。

表3 复方中草药对海豚链球菌的MIC和MBC

三、讨论

本文对小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散等10种复方中草药的抗海豚链球菌的活性进行了研究，研究发现，鲟源海豚链球菌对于小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散高度敏感，其抑菌圈直径分别达到了(25.34±0.37)、(24.52±1.03)、(23.26±0.41)毫米，小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散的MIC分别为31.25、31.25、62.5毫克/毫升，其MBC分别为125、62.5、125毫克/毫升。同时有研究表明，这3种方剂在抑菌方面有很好的效果。据袁长津等的研究，小柴胡汤及其加减方对乙型溶血性链球菌、嗜血流感杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠埃希菌均有不同程度的抑制效果，小柴胡汤对上述病原菌的MIC分别为200.00、100.00、100.00、250.00、200.00毫克/毫升。据迟丹的研究，芍药汤在临床上治疗细菌性的痢疾具有明显的效果，在其治疗组19例中,治愈11例(57.9%)、 有 效6例(31.6%)、 无 效2例(10.5%)，总有效率为89.5%。据吴亚等的研究，玉屏风散对热带假丝酵母菌具有良好的抑菌效果，其MIC在50～200毫克/毫升。据吴颖瑞等的研究，甘草、黄连对罗非鱼源海豚链球菌均有一定的抑制效果，而这两味药刚好是小柴胡汤和芍药汤中的组成成分，而复方中草药有更强的抑菌效果，这与邓凯伟等在对引发奶牛隐性乳腺炎的金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌进行体外抑菌实验所得出的结论相一致，即复方中草药因为其合理的配伍作用，能发挥出药物间的相辅相成作用，可增强单方中草药的抑菌作用。

在本研究中，鲟源海豚链球菌对黄连解毒汤、茵陈蒿汤、痛泄要方和升麻葛根汤为中度敏感，其抑菌直径都在14.49～17.45毫米。据刘平等的研究，黄连解毒汤对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为125毫克/升，对肺炎克雷伯菌最小抑菌浓度为125毫克/升，与本实验所得的数据相一致。朱江等研究表明，茵陈蒿汤在消炎镇痛方面有显著的效果。据李辉等报道，痛泄要方在治疗小儿肠系膜淋巴结炎中有显著的作用。据秦汝兰等报道，升麻葛根汤对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有显著的抑菌作用，最小抑菌浓度分别为50、100毫克/毫升，其实验所得数据和本实验中对鲟源海豚链球菌的最小抑菌浓度有所差异，可能是因为供试菌株、实验地点、药液制备方法等有所差异造成的。

四、结论

在本实验条件下研究发现小柴胡汤、芍药汤和玉屏风散对鲟源海豚链球菌具有明显的抑制性，但其体外抑菌的机理还有待进一步研究明确，同时本实验的部分复方中草药具有明显的抑菌作用，但是能否运用到渔药开发上还有待进一步的实践。