SERS的煎炸食品中丙烯酰胺速测方法研究

程 劼，韩彩芹，谢建春，苏晓鸥*，王培龙*

1. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081 2. 江苏师范大学物理与电子工程学院，先进激光材料与器件江苏省重点实验室，江苏 徐州 221116 3. 北京工商大学，食品营养与人体健康先进创新中心，北京 100048

引 言

丙烯酰胺(acrylamide, AAm)，1994年被国际癌症研究机构(IARC)列为2A级致癌物质。 研究表明，AAm具有神经毒性，生殖毒性，遗传毒性，免疫毒性。 其中神经毒性已经在人体内得到证实[1]。 AAm是工业上广泛使用的一种化工原料，在富含淀粉类食品(如马铃薯、烘烤面包，焙烤咖啡等)的高温加工中(通常>120℃)伴随着美拉德反应产生。 存在于食品中的AAm对人体存在极大的暴露风险。 2012年，欧洲食品安全局(EFSA)制定食品中AAm的限量水平[2]。 2017年，欧盟明确了食品原料中如面包，烘烤咖啡，婴幼儿食品中AAm的限量值为300～850 μg·kg-1 [3]。 对AAm的控制和监控势在必行。 目前，分析AAm的方法主要包括大型仪器设备分析和快速分析两大类。 前者一般包括如气相色谱-质谱联用[4]、液相色谱串联质谱[5]等方法。 这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且样品前处理过程较为复杂。 近年来，也有一些基于比色法[6]、量子点磷光探针[7]、荧光猝灭传感[8]等快速分析方法的报道。 表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering，SERS)是近年来发展迅速的一种快速检测技术，它是入射光激发纳米尺度金属材料产生的一种拉曼散射增强效应，基于电磁场物理增强(EM)和化学电荷转移化学增强(CT)的增强机制，可实现对单分子的高灵敏“指纹”识别，信号增强104～1014倍，检测灵敏度可达ng甚至pg水平。 借助SERS高灵敏分析的技术优势，利用SERS实现对AAm的检测分析也见文献报道。 如Wang等设计合成了PDA@AgNPs复合型纳米基底，实现了饮用水中AAm在0. 04 μg·L-1水平上的高灵敏分析[9]。 该方法灵敏度高，但基底保存周期较短(2个月)，一定程度上影响了方法的实用性。 Gezer研究组也开发了玉米蛋白负载纳米金复合增强体系，对AAm的检测灵敏度为10 μg·mL-1 [10]。 本课题组也开发出一种基于氧化石墨烯负载纳米金的增强基底，实现对煎炸食品中AAm的快速分析，检测时间9.5 min·样-1，灵敏度达2 μg·kg-1 [11]，基底保存周期180 d。 利用SERS实现对实际样品基质中目标物的高灵敏分析有两个重要因素。 一是基底构筑是实现高敏分析的关键，基底的稳定性决定了分析方法的实用性； 二是样品基质复杂，干扰成分多，需要辅助快速的样品前处理技术，最大程度降低样品基质的干扰。 基于分子印迹、抗体特异性识别等的技术可与SERS方法联用[12]，实现SERS分析前样品净化。 这其中，保证高回收率是关键。 研究采用QuECHERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)技术，结合AgNR@AuNPs复合基底，5 min内实现对煎炸食品中AAm的高灵敏分析。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

拉曼光谱仪(自行研制)： 785 nm激光器，10×物镜； 电子束蒸镀系统(DE 500, DE Technology)； 场发射电镜(SU 8010, Hitachi, Tokyo, Japan)。 丙烯酰胺(≥99%，Sigma-Aldrich)； 吸附剂(含4.0 g MgSO4和0.5 g NaCl，Agilent Technologies)； QuEChERS分散萃取料包(150 mg MgSO4，50 mg PSA，P/N: 5982—5022)； 银与钛(99.9%，Kurt J. Lesker)； 氯金酸(纯度≥99.0%，上海国药集团)； 10份煎炸样品采集于贵阳、厦门等3地市场。

1.2 基底制备与表征

AuNPs的制备采用经典的柠檬酸钠还原氯金酸的方法。 首先将氯金酸(1 Wt%, 50 mL)加热至沸腾，随后逐滴加入柠檬酸三钠(1 Wt%, 35 mL)，待混合物变成红褐色后继续加热20 min，撤去热源搅拌至室温。 AgNR的制备应用掠入射沉积法(oblique angle deposition)在电子束蒸镀系统上制备。 玻璃衬底用乙醇超声清洗5 min，N2流干燥，5×10-7Torr，溅射角0°。 依次钛(20 nm，0.2 nm·s-1)、银(100 nm, 0.3 nm·s-1)靶材镀膜，随后调整溅射角86°，镀膜2 000 nm。 最后通过射频等离子体(28 W)氩气清洗基底30 s。 场发射电镜进行基底结构表征。 以AAm标液(c=10 μg·L-1) 为探针，测试AuNPs (70 nm)，AgNPs (70 nm)，AgNR，AgNR@AuNPs的SERS活性。

1.3 样品前处理与SERS分析

1.0 g样品中加入4 mL正己烷，在陶瓷均质器中混匀1 min。 依次加入8 mL混合溶剂(水/乙腈，V/V=1∶1)和吸附剂，混合1 min，12 000 r·min-1离心10 s，移取下层1 mL，加入QuEChERS分散固相萃取料包，振荡20 s，12 000 r·min-1离心10 s，收集上层液待测。 分别移取10 μL AuNPs与10 μL待测液混合，分取10 μL于AgNR表面，进行拉曼光谱扫描。 单次扫描时间4 s，扫描5个点取平均，光谱采用“Savitzky-Golay”二阶导数变换法处理。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

AgNR@AuNPs中AgNR长L=(990±50) nm； 直径D=(100±8) nm； Ag阵列间距S=(105±10) nm，AgNR水平倾角β=74°±2°。 AuNPs粒径70 nm。 AuNPs分别负载于AgNR表面及AgNR纳米棒之间，产生高密度增强“热点”(图1)。

图1 AgNR SEM (a)俯视图； (b) 剖面图； 复合基底SEM (c) 俯视图； (d) 剖面图

Fig.1(a)Topviewand(b)cross-sectionalSEMimagesoftheAgNRsubstrate; (C)Topviewand(D)cross-sectionalSEMimagesofthecompositesubstrate

2.2 基底优化与SERS活性

样品混合顺序也影响分析灵敏度。 图3对比了两种混合顺序，即(1)将样品首先与AuNPs混合，然后再转移至AgNR上； (2)将AuNPs转移至AgNR上，再加入样品对SERS分析的影响。 方法(1)比(2)具有更高的I1 482。 样品中AAm首先与AuNPs相互作用，形成“静电复合物”，更多的AAm受AuNPs热点影响，转移至AgNR表面后，部分未发生作用的AAm在AgNR热点作用下，也同时产生SERS信号。 而将AuNPs预先转移至AgNR表面，样品后加入，AAm在液固界面分布较为分散，处于热点区域AAm浓度较低，表现出较弱的I1 482。

图2 (a)四种基底拉曼活性对比; (b) 柠檬酸钠用量对I1 482影响

Fig.2(a)TheenhancedSERSspectraofAAmstandardsolutioninthepresenceoffourdifferentsubstrates; (b)DifferentadditionamountsofaqueoussodiumcitratevsI1 482

图3 操作顺序影响

2.3 基底保存稳定性

AgNR@AuNPs表面容易被氧化，需充氮密封保存。 每次使用前利用稀硝酸(10-7mol·L-1)浸没清洗基底，除去表面氧化物，随后用无水甲醇冲洗两次，自然风干后使用。 为考察基底稳定性，在第0, 1, 3, 7, 14, 30, 60, 120和180 d进行基底活性测试。 从图4中可以看到基底在0～180 d内，I1 482基本趋于稳定，RSD=7.73%。

图4 基底保存时间对I1 482影响

2.4 样品前处理

2.4.1 除脂溶剂优化

煎炸类食品富含油脂类化合物，去除油脂干扰有利于提高SERS分析的灵敏度。 以油条(GC-MS方法确证[14])为考察基质，对比正己烷、环己烷和甲苯的除脂效果。 如图5所示，正己烷除脂最佳。

图5 除脂溶剂效果对比

2.4.2 提取溶剂优化

AAm极性较强，常选用水作为提取溶剂。 以油条、薯条和油炸方便面为基质，赋值浓度10 μg·kg-1。 表1可以看到，利用水∶乙腈(V/V=1∶1)作为提取溶剂，回收率高于水和乙腈。 进一步优化了水与乙腈的用量比，固定提取溶剂体积8 mL，体积比在1∶7～7∶1之间变化，回收率见表1。 当水∶乙腈(V/V=1∶1)时，回收率较佳。

表1 提取溶剂优选

2.4.3 QuECHERS材料优选

比较了两种净化材料(MgSO44.0 g+NaCl 0.5 g和MgSO44.0 g+CH3COONa 2.0 g)的净化效果。 选择MgSO4+NaCl作为净化材料回收率较高，这可能是由于NaCl具有防止乳化的功能，此结果与文献报道一致[15]。

表2 QuECHERS材料对回收率的影响

2.5 方法性能

选择油炸方便面作为基质(GC-MS分析AAm阴性)，赋值样品浓度分别为c=5, 10, 30, 50, 100 μg·kg-1。 图6所示I1 482与c呈较好线性关系(R2=0.985)。 灵敏度(1 μg·kg-1)采用空白样品I1 478三倍标准偏差计算所得，结果通过添加回收验证，灵敏度高于EU规定的限量标准(300～800 μg·kg-1)，能满足实际应用的需求。 也对薯条、油条等基质进行了线性和灵敏度测试，由于每种类型基质组成的差异性，SERS反映的背景吸收也不同，但I1 478处与c相关性良好，结果相似。

图6 基质添加谱图与线性曲线

方法回收率，精密度和稳定性通过基质添加考察(表3)。 对于薯条和方便面基质，回收率与课题组先前研究的利用石墨烯负载纳米金进行AAm分析所得数据几乎一致[13]，这也证明了方法的可靠性。 在5个浓度水平下回收率77.1%～93.6%，RSD均小于4.0%，回收率和精密度与原有报道相比均有所改善。 日间与日内精密度RSD从原来6.8%下降至5.5%。 这可能是由于与液相基底相比，AgNR固相基底的有序性提高了分析稳定性。

表3 回收率

表4 日间与日内精密度

2.6 样品分析

采用建立的SERS方法对10份煎炸样品进行分析，并与GC-MS进行对比。 从表5中可发现，SERS没有出现“假阴性”或者“假阳性”，但结果普遍比GC-MS结果高，这可能与所用拉曼光谱仪分辨率有关系，较低分辨导致Δν=1 482 cm-1处重叠峰无法分离和识别。

表5 实际样品分析结果

a浓度低于方法检测限(1 μg·kg-1)

abelow the detection limit (1 μg·kg-1)

3 结 论

建立了一种基于复合纳米结构的煎炸食品中丙烯酰胺的SERS快速分析方法。 利用AgNR@AuNPs作为增强基底，基底保存时间不少于180天，并结合QuECHERS净化方法，5 min内完成检测，分析灵敏度1 μg·kg-1，在5～100 μg·kg-1浓度范围内实现定量分析(R2=0.985)，平均回收率77.1%～93.6%，RSD小于4.0%。 所建立的方法有望用于食品安全现场快速检测。