调控FOXM1基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响

谢 佳，曾春兰，王 俊，赵 攀 (重庆两江新区第一人民医院普外科，重庆401121)

乳腺癌是一种在女性中常见的恶性肿瘤，随着社会的快速发展，乳腺癌的发病率逐渐升高，且发病人群逐渐趋于年轻化，严重影响女性人群的生活质量[1-3]。FOXM1属于FOX基因家族中的一员，参与多种恶性肿瘤的发生，在肿瘤患者中呈高表达状态[4]。有研究表明，FOXM1在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤中的表达均高于正常人[4]。临床上乳腺癌常采用化学治疗，其中赫赛汀为常用一线药物，但目前对于赫赛汀具体的使用剂量无明确的定论，不同研究使用的剂量也有所不同[5-7]。本研究通过调控FOXM1基因，探究其对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响，以期为乳腺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌BT474细胞购自上海泽业生物科技有限公司。主要试剂：赫赛汀，购自Genentech 罗氏子公司基因泰克(国药准字J20110020)；兔抗大鼠FOXM1抗体购自Proteintech中国公司，小鼠抗大鼠PI3K、p-PI3K抗体、兔抗人AKT、p-AKT抗体均购自上海陶素生化科技有限公司，MTT试剂盒、Transwell试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的乳腺癌BT474细胞取出后，快速采用40 ℃的温度火浴，迅速摇晃均匀至融化，加入2 mL的完全培养基(10%PBS，10%～15%的56 mL胎牛血清，1%的5.56 mL青链霉素，500 mL RPMI1640培养基)，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液，使用完全培养基重悬，传代至培养瓶中，培养体系为5 mL，置于CO2培养箱中培养(饱和湿度95%、温度37 ℃、CO2浓度5%)，第2天换液，当培养瓶中细胞融合率达到80%～90%时进行传代。

1.2.2 转染及分组 构建FOXM1过表达、FOXM1-shRNA质粒，取对数的生长期乳腺癌BT474细胞，每孔中大约20×104个BT474细胞，接种于6孔板中，对其进行培养，培养24 h后，按照转染试剂说明书将100 nmol/L FOXM1、100 nmol/L FOXM1-siRNA及RPMI1640培养液3组中均加入BT474细胞进行转染。转染后继续培养48 h，提取细胞蛋白。按转染物的不同，将细胞分为上调FOXM1基因组(转染FOXM1)、下调FOXM1基因(转染FOXM1-siRNA)和对照组(加入等体积空载体质粒)。

1.2.3 Western blot检测FOXM1蛋白的表达 将采集到的细胞，使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，裂解处理35 min，之后提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。每孔加入20 μg蛋白，通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液100 V恒压，电泳120 min，350 mA恒流，电转90 min，之后再将电转膜浸泡在10%的牛奶中，37 ℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST按1∶1 000稀释FOXM1和β-actin一抗，在4 ℃的环境下孵育过夜保存；24 h后用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液反复清洗。最后加入显影剂将其浸在底物溶液中进行显色，严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行。

1.2.4 不同浓度赫赛汀药物干预 细胞转染48 h后，收集细胞制成细胞悬液，将细胞按照每孔2.0×104(100 μL)，接种于96孔板中，培养细胞过夜后，基于前期预实验的趋势各加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L低、中、高浓度的赫赛汀，置于恒温37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，吸取各孔内的培养液，对照组使用0.1%的DMSO完全培养液培养，上调FOXM1基因组、下调FOXM1基因组分别使用不同浓度的赫赛汀进行培养。

1.2.5 MTT法检测不同浓度赫赛汀对BT474细胞增殖能力的影响 待所有细胞组培养到相应的时间后，在每孔中加入MTT 20 μL继续孵育4 h，将上清液仔细吸取，然后在孔中加入150 μL的DMSO，振荡10 s，采用酶标仪测定波长为570 mm的细胞组OD值，按照肿瘤细胞增殖率计算公式，增殖率=(细胞组OD值/参照值-1)×100%，计算BT474细胞的增殖率。

1.2.6 细胞划痕实验 将乳腺癌BT474细胞接种到18孔板中，待细胞增长到90%时，使用100 μL的枪头,垂直划出3条直线。之后经过PBS缓冲液清洗2～3次，分别加入0.5%的完全培养基培养24 h后使用倒置显微镜观察各组细胞的迁移变化。

1.2.7 Transwell实验检测不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的侵袭能力 将处于对数生长期的BT474细胞取出，调整细胞密度为3×105/mL，并使用浓度为1%的完全培养基重悬细胞，将100 μL的细胞悬液加入每个小室中。在培养板上放入Transwell小室，加入无血清培养基，静置30 min后使基质胶再水化。向Transwell小室中加入细胞悬液，混合血清培养基在饱和湿度环境下培养24 h，之后进行染色处理，将其取出用PBS缓冲液漂洗，使用多聚甲醛将其固定后采用结晶紫染色法进行染色，每组均染色15 min，最后用PBS漂洗3次。使用显微镜对随机选取的5个小孔视野拍照，每组进行3次细胞数目统计。

1.2.8 适宜赫赛汀浓度下PI3K/AKT信号通路蛋白检测 使用Western blot对PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白进行检测，方法同1.2.3。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 荧光显微镜下BT474细胞转染FOXM1过表达和FOXM1-siRNA效果

BT474细胞成功转染FOXM1过表达和FOXM1-siRNA的荧光质粒以及空载荧光质粒。显微镜下观察转染效率达到60%以上(图1)。

图1 荧光显微镜下BT474细胞与BT474细胞成功转染FOXM1及FOXM1-siRNA图(×200)

2.2 干预FOXM1基因后FOXM1蛋白相对表达量比较

上调FOXM1基因组中FOXM1蛋白的相对表达量明显增高，是对照组的1.5倍，而下调FOXM1基因组中FOXM1蛋白的相对表达量明显减少，是对照组的30%，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

*：与对照组比较，P<0.05

图2 对照组、上调FOXM1基因组和下调FOXM1基因组FOXM1蛋白相对表达量比较

2.3 不同浓度赫赛汀对BT474细胞增殖能力的影响

上调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率显著高于对照组，且随着赫赛汀浓度的增加增殖率逐渐增加，上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性，促进增殖(图3)。下调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率显著低于对照组，低浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖能力的抑制程度较弱，高浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖能力的抑制过度，而中浓度的赫赛汀增殖抑制能力介于低、高浓度之间，能够有效地抑制BT474细胞增殖，但无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下，下调FOXM1基因组细胞的增殖率显著低于上调FOXM1基因组。

图3 不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的增殖能力比较

2.4 不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的迁移能力比较

上调FOXM1基因组BT474细胞的迁移数量显著多于对照组，且随着赫赛汀浓度的增加迁移数量逐渐增加，上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性，促进迁移(图4)。下调FOXM1基因组BT474细胞的迁移数量显著少于对照组，低浓度的赫赛汀对BT474细胞的迁移能力的抑制程度较弱，高浓度的赫赛汀对BT474细胞的迁移能力的抑制过度，而中浓度的赫赛汀对细胞迁移的影响介于低、高浓度之间，能够有效地抑制BT474细胞迁移，无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下，下调FOXM1基因组细胞的迁移数量显著低于上调FOXM1基因组。

图4 不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的迁移能力比较

2.5 不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的侵袭能力比较

上调FOXM1基因组BT474细胞的侵袭数量显著多于对照组，且随着赫赛汀浓度的增加侵袭数量逐渐增加，上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性，促进侵袭(图5)。下调FOXM1基因组BT474细胞的侵袭数量显著少于对照组，低浓度的赫赛汀对BT474细胞的侵袭能力的抑制程度较弱，高浓度的赫赛汀对BT474细胞的侵袭能力的抑制过度，而中浓度的赫赛汀对细胞侵袭能力介于低、高浓度之间，能够有效地抑制BT474细胞侵袭，无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下下调FOXM1基因组细胞的侵袭数量显著少于上调FOXM1基因组。

图5 不同浓度赫赛汀药物下BT474细胞的侵袭能力比较

2.6 适宜赫赛汀浓度下3组PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量比较

基于上述研究结果，低浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制程度较弱，高浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制过度，而中浓度的赫赛汀的抑制能力介于低、高浓度之间，能够有效地抑制BT474细胞增殖、迁移及侵袭，无抑制过度的表现。因此，使用5 μmol/L赫赛汀抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭为适宜浓度，既能抑制但又无抑制过度的表现。因此在5 μmol/L赫赛汀浓度下检测3组PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量。下调FOXM1基因组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均低于对照组和上调FOXM1基因组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图6。

*：与对照组比较P<0.05

图6 适宜赫赛汀浓度下3组PI3K/AKT信号通路蛋白相对表达量比较

3 讨论

FOXM1在乳腺癌患者中呈现出异常表达，参与乳腺癌的发生和发展，可能是乳腺癌分子治疗的新靶点[8-9]。赫赛汀作为靶向治疗乳腺癌的药物之一，其应用剂量暂无明确的规定，不同浓度的赫赛汀对乳腺癌细胞的影响不同[10-12]。本研究通过调控FOXM1基因，建立上调基因组和下调基因组，对比研究上调和下调FOXM1基因，在赫赛汀的不同浓度下对乳腺癌BT474细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。

本研究选取乳腺癌BT474细胞作为研究对象，分别转染FOXM1和FOXM1-siRNA，分为上调FOXM1基因组和下调FOXM1基因组，并设置正常乳腺癌BT474细胞对照组，运用不同浓度的赫赛汀进行干预，探究调控FOXM1基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的作用。有研究表明，FOXM1蛋白在乳腺癌患者中的表达显著高于健康人群[13-14]。本研究建立上调FOXM1基因组和下调FOXM1基因组后，对其FOXM1蛋白水平进行检测，结果显示，与对照组相比，上调FOXM1基因组细胞FOXM1蛋白的水平显著升高，下调FOXM1基因组FOXM1蛋白水平显著降低，说明下调FOXM1基因可有效抑制FOXM1蛋白的表达，与临床上多项研究中，调控FOXM1基因可对FOXM1蛋白的高表达进行抑制的研究一致[15-16]。有多项研究表明，对乳腺癌患者使用不同浓度的赫赛汀进行干预治疗，患者效果不一，临床对于赫赛汀的使用剂量尚无统一的标准[17-19]。本研究中，设置1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 3个浓度，分别对上调FOXM1基因组、下调FOXM1基因组进行干预，探讨其对不同浓度下乳腺癌细胞增殖率的影响。结果显示，不同浓度下下调FOXM1基因组的细胞增殖率均低于对照组及上调FOXM1基因组。有研究对FOXM1基因进下调，检测下调FOXM1基因对乳腺癌细胞增殖的影响，结果显示，下调FOXM1基因能够有效抑制乳腺癌细胞增殖，抑制乳腺癌的恶化，起到抵抗癌细胞增殖的作用，本研究中下调FOXM1基因能够抑制乳腺癌BT474细胞增殖的研究结果与之一致[20-21]。另外本研究对不同浓度赫赛汀下3组细胞迁移、侵袭能力进行检测，结果显示，下调FOXM1基因组在不同浓度赫赛汀作用下乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力均低于上调FOXM1基因组和对照组，与临床上多项研究中，通过调控FOXM1基因能够有效抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的研究结果一致[22-23]。

本研究使用不同浓度的赫赛汀对细胞进行培养干预，结果显示，低浓度的赫赛汀对乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制程度较弱，高浓度的赫赛汀对乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力出现抑制过度，而中浓度抑制作用介于低、高浓度之间，能够有效地抑制乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，无抑制过度的表现。说明使用5 μmol/L赫赛汀抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭为适宜浓度，既能抑制又无抑制过度的表现。有研究表明，使用不同浓度的赫赛汀对乳腺癌患者进行治疗，其适宜浓度能够有效抑制乳腺癌的恶化，治疗效果较为理想，本研究结果与之一致[24-26]。研究表明，PI3K/AKT信号通路参与乳腺癌的发展，与乳腺癌细胞的迁移、侵袭有明显的相关性[27-29]。乳腺癌患者中PI3K/AKT信号通路蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表达水平显著升高[30-33]。本研究采用5 μmol/L赫赛汀干预乳腺癌BT474细胞，并对PI3K/AKT信号通路蛋白进行检测，结果显示，下调FOXM1基因组PI3K/AKT信号通路中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达水平均显著低于上调FOXM1基因组及对照组，说明下调FOXM1基因组在适宜赫赛汀浓度下能够有效调节PI3K/AKT信号通路，从降低PI3K/AKT信号通路蛋白水平，达到抑制乳腺癌发展的目的。

综上所述，上调FOXM1基因可增强乳腺癌BT474细胞对赫赛汀的耐药性，下调FOXM1基因在5 μmol/L赫赛汀的干预下，可通过作用于PI3K/AKT信号通路，抑制乳腺癌BT474细胞的增殖、迁移及侵袭，从而抑制乳腺癌的发展。