多浪羊NCOA1基因多态性与产羔数的相关分析

牛志刚,王 珊,常 璐,史洪才

(新疆畜牧科学院 生物技术研究所/农业农村部 草食家畜繁育生物技术重点开放实验室,新疆 乌鲁木齐 830026)

多浪羊是新疆一个以肉用为主、肉脂兼用型地方绵羊品种,主要分布在新疆南部地区的叶尔羌河流域、塔里木盆地西南边缘地区。多浪羊具有体型高大、生长发育快、早熟、产肉和繁殖率高、适应性强、遗传性稳定、饲料报酬高等特点。多浪羊母羊四季均可发情,以4～5月和9～11月发情较多,发情周期18 d,发情持续期24～48 h,妊娠期150 d,平均产羔率130%左右。多浪羊是新疆南疆地区非常优良的肉羊品种,因此提高多浪羊的繁殖性能对新疆南疆畜牧业发展具有重大意义。陈晓军等[1]、钟发刚等[2]、史洪才等[3]对多浪羊的FecB基因进行了多态性分析,发现新疆多浪羊存在两种基因型(B+、++ ),其中B+型在多浪羊体内为优势基因型,说明多浪羊的多胎性能与FecB基因密切相关。本课题组近年来利用FecB基因分子标记辅助育种培育多浪羊多羔新品系,已取得了显著的效果,多羔育种核心群的平均产羔率达到149%。在此基础上,本课题组利用全基因组重测序技术,通过比较产单羔组与产双羔组的差异,挖掘了影响多浪羊繁殖性状的相关基因和分子标记,最终富集分析筛选了NCOA1、INHBA、ACP1、ING5、ARNT、KLHL1等一些候选基因。

核受体辅激活因子1(Nuclear receptor coactivator 1, NCOA1),又被命名为类固醇受体辅活化因子-1(steroid receptor coactivator-1, SRC-1),属于对配体有依赖性的转录因子,是p160类固醇受体辅助活化因子家族成员中的一员[4]。Razeto A等[5]提出了NCOA1是生殖激素“开关”的观点,认为生殖激素长时间打开是导致哺乳动物繁殖性能增加的原因。NCOA1蛋白的作用是通过与结合到DNA上的核受体相互作用来增强转录活性,NCOA1 蛋白可以调节与繁殖性状有关基因的转录,从而影响这些基因的表达,进而影响哺乳动物的繁殖性能。NCOA1基因和NCOA3基因协同作用可以调节胎盘的形态以及胚胎的存活率[6]。NCOA1基因在不同组织(下丘脑、垂体、卵巢和子宫)中均有表达,并且对妊娠期起到重要的调节作用[7]。我们以新疆多浪羊为研究对象,对NCOA1基因的1个内显子和1个外显子序列进行克隆,分析了Ncoa1基因不同基因型SNP位点的多态性,以期探讨NCOA1基因与多浪羊产羔性状的相关性,为多浪羊多胎新品系的选育奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在新疆喀什麦盖提县的多浪羊养殖场采集产单羔母羊(112只),以及产双羔和三羔母羊(56只)；从颈静脉采血,所采血样量均为5 mL/只,用肝素钠抗凝,于-20 ℃冻存。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶、dNTP购于北京天根生物技术有限公司,限制性内切酶AluⅠ、DNA Marker等购自BBI公司。

1.3 DNA的提取

用北京全式金生物技术有限公司生产的Easy Pure Blood Genomic DNA Kit试剂盒提取DNA。

1.4 引物设计

根据GenBank上公布的绵羊NCOA1基因序列(登陆号为NC-019460.2),利用引物设计软件Pimer 6.0进行引物设计,对NCOA1基因的1个外显子、1个内含子设计2对引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物信息见表1。

表1 设计的引物信息

1.5 PCR扩增及产物检测

利用设计的引物对多浪羊的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL:2 ×Buffer(含Mg2+2.5 U/μL)25 μL、上下游引物各1.0 μL、50 ng/μL的DNA 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、TaqDNA聚合酶1 μL，用灭菌双蒸水补至50 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,62～55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将上述PCR产物进行纯化回收后,送至上海生工生物有限公司进行测序。

1.6 数据分析

用DNAStar软件对NCOA1基因外显子的测序结果进行序列比对和分析,计算NCOA1基因的SNP位点在新疆多浪羊群体中的等位基因频率、杂合度(heterozygosity, He)、有效等位基因数(number of effective allele, Ne)、群体遗传纯合度(homozygosity, Ho)、多态信息含量(polymorphism information content, PIC)和基因型频率;用SPSS 19.0软件中的最小二乘法分析个体不同基因型与多浪羊产羔数的关联效应。

2 结果与分析

2.1 NCOA1基因的PCR扩增结果

对Ncoa12和Ncoa17引物进行PCR扩增,对PCR产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果发现,扩增片段大小与预期一致,片段长度分别为461和416 bp,特异性好，且电泳条带清晰明亮(图1和图2),可进行下一步检测。

2.2 NCOA1基因测序结果

对PCR产物进行测序,结果在NCOA1基因序列中内含子12发现了g.166 397 A>C突变位点,检测到两种基因型，分别为AA和AB基因型(图3)。在外显子17的g.187 501 G>A突变位点,检测到3种基因型，分别为BB、AB和AA基因型。序列分析结果(图4)表明,在外显子17的g.187 501 G>A突变位点发生了错义突变,由原编码的丝氨酸(Ser)改变为谷酰胺酸(Gln)。

图1 NCOA1基因内含子12的PCR扩增电泳图

2.3 基因频率和基因型频率

对NCOA1基因多态位点的基因频率、基因型频率进行统计分析，结果(表2)显示：在多浪羊群体中,g.166 397 A>C位点的优势基因型为AA基因型,基因型频率为0.936；优势基因为A等位基因,基因频率为0.968。在多浪羊群体中, g.187 501 G>A位点的优势基因型为BB基因型,基因型频率为0.500；优势基因为B等位基因,基因频率为0.643。

图3 g.166 397 A>C的测序结果

图4 g.187 501 G>A的测序结果

2.4 NCOA1基因SNP位点基因座的遗传多态性分析

采用软件进行卡方适合性检验，结果表明:新疆多浪羊g.166 397 A>C和g.187 501 G>A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明多浪羊NCOA1基因突变位点的基因型频率没有受到选择、突变或迁移等因素的影响。对多浪羊群体在NCOA1基因的2个SNP位点的纯合度、杂合度、有效等位基因数以及多态信息含量进行统计分析,计算结果(表3)表明,多浪羊群体中NCOA1基因的g.166 397 A>C和g.187 501 G>A位点的多态信息含量分别属于低度多态(PIC<0.25)和中度多态(0.25

2.5 多浪羊群体NCOA1基因的SNP位点与产羔数的相关性分析

由表4可知：多浪羊NCOA1基因的g.166 397 A>C突变位点的AA基因型个体产羔数显著高于BB基因型个体的(P<0.05);多浪羊NCOA1基因的g.187 501 G>A突变位点的BB基因型个体的产羔数显著高于AA和AB基因型个体的(P<0.05),AA、AB基因型个体之间差异不显著。

表2 基因频率和基因型频率

表3 多浪羊群体多态位点的多态信息含量、纯合度、杂合度和等位基因数

注:PIC>0.50为高度多态；0.25

3 讨论

研究发现核受体辅激活蛋白1(NCOA1)基因是影响猪繁殖性状的一个候选基因并定位于猪3号染色体上。人的NCOA1基因总共有183.4 kb,含有22个外显子,其cDNA长度为4721 bp。猪的NCOA1基因总共有97681 bp,含有19个外显子,其cDNA长度为4451 bp。绵羊的NCOA1基因的编码区全长为218477 bp,共有9种可变剪切体,含有21或22个外显子。NCOA1蛋白通过与结合到DNA上的雌激素受体和雄激素受体相互作用来增强转录活性,刺激特定的雌激素和雄激素反应基因的转录并调节随后的生理反应,作用于动物的生长发育、体内微生态平衡以及繁殖等生理过程[8-10]。霍自双等[11]对红眼白水貂的NCOA1基因多态性及其与繁殖性状的相关性进行了分析，发现在NCOA1基因上存在1个多态位点,为第6外显子处g.151 536T>C突变,且AB基因型个体的总产仔数和产活仔数均极显著高于AA基因型个体的(P<0.01)。胡慧艳等[12]在英系和美系大白猪NCOA1基因多态位点均检测到AA、AB两种基因型。武子寅等[13]在邵伯鸡母系NCOA1多态性与产蛋性能的相关研究中发现,该基因在第10外显子多态位点,AA型的产蛋数极显著高于BB型的,且显著高于AB型的。李涛等[14]对大白母猪的NCOA1基因进行了多态性与繁殖性能的关联分析,发现经产母猪NCOA1基因中AB型个体的总产仔数显著高于AA型个体的。李永辉研究发现长白猪与大白猪均存在3种基因型,且在不同基因型之间总产仔数与产活仔数均差异极显著[15],说明NCOA1可能是影响猪产仔数的一个候选基因。NCOA1基因是否调控绵羊的繁殖性能,尚未见相关报道。本研究将NCOA1基因作为影响多浪羊产羔性状的候选基因,利用PCR直接测序技术分析了NCOA1基因的多态性及其与多浪羊繁殖性状的相关性，发现在NCOA1内含子12处的g.166 397 A>C突变位点产生了AA、AB两种基因型,AA基因型为优势基因型，且在AA与AB基因型个体间产羔数存在显著差异；在NCOA1外显子17处的g.187 501 G>A突变位点产生了AA、AB、BB三种基因型,BB基因型为优势基因型,在该突变点发生了错义突变,使原编码的丝氨酸(Ser)改变为谷酰胺酸(Gln)，且在AA与BB基因型、AB与BB基因型个体间产羔数均存在显著差异，说明NCOA1基因对多浪羊产羔性状的效应是显著的,表明NCOA1基因可以作为多浪羊产羔性状的主要候选基因。关于新疆多浪羊的繁殖性能仍需进行深入研究,比如可以将NCOA1基因作为分子遗传标记,对新疆多浪羊进行标记辅助选种选配,从而提高多浪羊的繁殖性能，这将对新疆南疆畜牧业的发展具有重大意义。

表4 NCOA1基因SNP位点与多浪羊产羔数的相关性

注:在不同基因型之间进行比较,数据后有任一字母不同者为差异显著(P<0.05)。