颅骨直接穿刺单次注血制作脑表面铁质沉积模型的可行性研究

黄帅, 邵园, 明帅, 杨巍, 叶琴, 崔思嘉, 龚向阳

中枢神经系统表面铁质沉积症(superficial side-rosis of the central nervous system,SS-CNS)是由软脑(脊)膜、软脑(脊)膜下和室管膜下含铁血黄素沉积所导致的一组临床综合征。病程通常是不可逆的，典型临床表现为小脑性共济失调、神经性耳聋和锥体束征[1]。SS-CNS在MRI上表现为特征性的、沿脑表面分布的低信号带，以T2WI和磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging，SWI)等序列较为敏感[2-3]。解剖大体标本可在脑表面观察到焦黄色物质沉积[4]。大量的临床病例报告提示65%的SS-CNS患者存在引起少量、持续性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的基础疾病，如中枢神经肿瘤、头颈部外伤、动静脉血管畸形和动脉瘤、手术、臂丛损伤及脑淀粉样血管病等[5-6]。

近期有文献报道，在脑外伤伴有SAH患者、或者动脉瘤破裂引发SAH患者的MRI随访中，发现部分患者存在SS-CNS现象，说明单次SAH也可能引起脑表面铁质沉积[7-8]。但是临床上此类患者的病史较为复杂，既往可能存在脑表面微出血病史，并不能证实SS-CNS是由单次SAH所导致。本研究拟通过应用颅骨直接穿刺单次注血建立家兔SAH模型，研究单次SAH导致SS-CNS的可能性及发生率。

材料与方法

1.实验动物

普通级新西兰兔38只，体重2.2～3.1 kg，平均2.5 kg，雌雄不限，月龄6～9个月。由浙江中医药大学动物实验中心提供，购买于浙江省新昌县大市聚镇欣健兔场。实验动物在标准环境下饲养(室温22℃～27℃，湿度40%～60%，12 h昼夜循环光照)。实验过程对动物各项处置符合动物伦理学标准。

2.实验材料

主要用药：盐酸赛拉嗪注射液(xylazine hydrochloride)，生产厂家为吉林省华牧动物保健品有限公司，规格为2 mL；3%戊巴比妥溶液(pentobarbital)；碘克沙醇(iodixanol)，生产厂家为江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为100 mL；10%福尔马林溶液(formalin)。

实验器械：颅骨钻孔器(生产厂家为捷力特，中国浙江)；自制骨穿针由医用16G穿刺活检针剪短、打磨而成，保留活检针尾部3 cm，带定位夹(图1a)；咬骨钳。

影像设备：Toshiba Aquilion ONE 640层螺旋CT扫描仪；GE Discovery MR 750 3.0T磁共振扫描仪和Magtron WK200-D 8通道相控阵兔实验专用线圈。Nikon eclipse 80i显微镜。

病理染色液：普鲁士蓝染色试剂盒(Perls stain，伊红法)， 生产厂家为北京市索莱宝(Solar bio)科技有限公司。

3.造模方法

实验前准备：新西兰兔术前禁食、禁水8 h，肌注速眠新0.15 mL/kg，经兔耳缘静脉注射戊巴比妥溶液(剂量为0.5 mL/kg)。待麻醉成功后，经一侧耳缘动脉取动脉血1.5～2.0 mL注入肝素化容器，并缓慢加入CT对比剂碘克沙醇(320 mg I/mL)0.5 mL备用。

CT引导下穿刺及注血：穿刺点为颅骨中线额部与枕部连线中点偏左侧约1 cm位置处，穿刺目标为左侧幕上大脑半球表面的蛛网膜下腔间隙。常规剪毛、消毒、铺巾，使用颅骨钻孔器钻孔，插入自制的骨穿刺针。在CT引导下调节穿刺位置和方向，穿刺深度约2 mm，扫描确认穿刺针尖位于蛛网膜下腔后，使用针筒缓慢推注混合有CT对比剂的兔自体动脉血，总量1.0～1.5 mL。推注完毕后，再次行CT扫描确认兔脑表面有稍高密度影(混合对比剂的自体动脉血)分布、且无明确脑内血肿即表明SAH引发成功(图1)。拔除穿刺针、压迫止血、封闭创口，确定无脑脊液和血液从穿刺口溢出后，转移至CT机房外头低足高位放置30min。

注血后处置：将完成SAH造模的新西兰兔分为两组，送回浙江中医药大学动物实验中心常规方法饲养，A组20只饲养105天，B组11只饲养154天。饲养过程中观察新西兰兔进食、活动情况，无特殊抗感染、营养输液等处理。

4.影像及病理检查

MRI检查：采用上述方法将兔常规麻醉。检查时兔俯卧位于检查台上，头部正中矢状线与与扫描矢状线重合，兔双侧外耳道连线为平面为冠状位基本平面，扫描序列及扫描参数见表1。

大体标本获取： MR检查后3天内处死实验兔。开胸经左心室主动脉插管，福尔马林灌注固定后，用咬骨钳除去颅盖取完整脑组织，放入福尔马林容器中固定保存。固定一周后，摄兔脑组织大体表面照片。

病理检查：由同一位放射科医师对照分析CT穿刺图像、MR图像及脑组织大体表面照片，确定病理检查的靶层面，切取靶层面冠状位脑组织，常规组织脱水、透明、浸腊。然后沿冠状位以4μm厚度对脑组织进行连续切片并进行普鲁士蓝染色。

图1 颅骨穿刺注血。a)颅骨钻孔自制钻孔器，头部带有深度固定装置，防止穿刺过深；b)穿刺注血；c)注血后入CT机定位扫描，验证是否存在蛛网膜下腔出血；d)CT扫描验证软组织窗，脑表面可见线样的高密度(箭)，代表注射的混合有对比剂的动脉血； e)带针扫描验证骨窗，进针深度合适；f)不带针扫描，无金属放射伪影，蛛网膜下腔出血显示更清晰(箭)。

5.资料获取和诊断标准

资料获取：由2位放射科医师共同观察所有实验兔的颅脑CT和MR图像；由1位病理科医师在放射科医师的提示下，观察所有实验标本的普鲁士蓝染色。本研究以大体肉眼观、MR影像和普鲁士蓝铁染色三者同时观察到含铁血黄素沉着作为最终阳性病例。

诊断标准：对于大体标本，在脑表面邻近穿刺部位可肉眼观察到焦黄色物质为阳性，无则为阴性。在SWI序列MRI 上在脑表面观察到线性低信号(含铁血黄素)则为阳性，无则为阴性。显微镜下观察：无论部位，在脑表面有蓝色颗粒物沉积则为阳性，无颗粒样物质沉积为阴性。

6.统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件包进行统计学分析。以病理结果为金标准，采用Fisher精确概率检验对饲养105天(A组)与154天(B组)的兔标本中的阳性率进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

本组38只实验兔，麻醉过程中死亡3只，注血后未苏醒4只，剩余31只实验兔完成了颅骨直接穿刺注射自体动脉血，通过CT扫描均可在实验兔脑表面观察到高密度影(图1)。实验兔在苏醒后即送回动物房饲养。颅骨直接穿刺注血法制成SAH模型的成功率为81.6%(31/38)。

注射自体动脉血后，饲养过程中死亡6只，分别为术后第2天(2只)、3天(1只)、6天(2只)和8天(1只)，余下25只实验兔完成了全部实验过程，从注血到动物处死的时间间隔分别为105(A组，n=16)和154天(B组，n=9)。25只实验兔，有10只SS-CNS病理检查结果为阳性，由SAH发展为SS-CNS的发生率为40%(10/25)；其中A组有6只(6/16)，B组有4只(4/9)，两组间差异无统计学意义(P=0.53)。

SS-CNS造模后进行病理检查，肉眼观察大体标本呈阳性表现者11只，可观察到局部有3～5 mm大小的焦黄色区域，中心区域焦黄色较深，周围颜色较淡(图2)。病理检查有阳性表现者10只，普鲁士蓝染色可见蓝色颗粒样物质沉积于脑表面(图3)，其中有4只实验兔可以在颅脑的不同部位观察到蓝色颗粒样物质沉积。MRI显示脑表面有异常表现者11只，SWI序列上沿脑表面均可见低信号，在T2WI上有7只可以观察到脑表面的低信号(图4)。

讨 论

穿刺注血引发SAH的目的是为了制成SS-CNS模型，因此实验的关键步骤为成功建立SAH模型。在1969年，Offerhaus等[9]最先采用自体血注入蛛网膜下腔的方法来制备SAH模型，1988年，Endo等[10]采用结扎双侧颈总动脉后枕大池二次注血的方法制备兔症状性SAH模型，1995年，bederson等[11]和Veelken等[12]采用血管内丝线穿刺颈内动脉分叉处的方法成功建立了SAH模型，并能模拟SAH急性期的病理生理变化过程。但目前主流SAH造模方法均是为了研究SAH后的早期脑损伤(early brain injury，EBI)[13]，并不适用于对SAH远期并发症(如SS-CNS)的研究。且以上方法操作复杂，实验动物远期死亡率高。本文报道了针对SS-CNS的颅骨穿刺注血引发SAH的方法，操作简便并具有较高的成功率。传统SAH模型的出血量不易控制，极容易因颅内高压导致实验动物死亡。而本实验方法可以精准控制注血量，从而减少因颅内压过高所导致的实验兔死亡和实验失败。为了尽量避免穿刺中损伤脑组织，我们采取了以下措施：注血针的倾斜部分长度约1 mm，并且在针上设有一个卡位装置，防止穿刺过深，损伤脑表面。在穿刺过程中由CT引导穿刺，可以大致判断进针深度及针尖位置，同时可验证注入的血液是否位于蛛网膜下腔。最终病理和影像学观察也可以观察脑表面是否存在颅脑损伤。穿刺损伤脑组织后的病理改变其实与脑外伤后的病理改变有很多相似之处，临床上脑外伤继发SAH的患者也常伴随有颅骨骨折和脑组织的损伤，因此即使轻微的脑损伤也不会对实验最终结论造成很大影响。

图2 大体解剖标本，可见脑表面的褐色物质(箭)。 图3 普鲁士蓝染色病理片。a)镜下示蓝色线样及颗粒状物质(含铁血黄素，箭)沉积于脑表面(×40倍)； b) 镜下可见蓝色物质(箭)显示更清楚(×400倍)； c) 同一切片在另一处也可见蓝色物质(箭)沉积(×40倍)。

图4 MRI检查。a)MR T1WI上无明显病灶显示； b)T2WI上左侧顶叶可见少许低信号带(箭)；c) SWI序列上低信号带显示更清楚(箭)。

1960年有学者通过重复向实验犬的蛛网膜下腔注射右旋糖酐铁的方法复制出SS-CNS模型[14]。1991年Koeppen等[15-16]通过连续6个月向成年新西兰兔反复注射自体洗刷红细胞成功制出新西兰兔SS-CNS模型，Koeppen认为SS-CNS是脑组织反复接触红细胞崩解产物，并经过一个相当长的过程才得以形成SS-CNS，而单次SAH后的红细胞可被脑脊液清除，不会造成SS-CNS。因此，目前绝大多数的学者认为SS-CNS是由于慢性、长期、少量、重复的SAH引起[17]。但是目前为止尚没有学者采用单次的自体血蛛网膜下腔注射来制作SS-CNS模型。本研究首个采用单次的自体动脉血蛛网膜下腔注射来制作SS-CNS病理模型，并且通过病理检查及影像学检查验证该模型。颅骨穿刺单次注血法模拟SAH的血液主要集中于大脑皮层表面，出血范围比传统SAH造模方法例如颅内动脉穿刺等出血范围更为集中，从而更易引起含铁血黄素脑表面沉积，是一种比较适合SS-CNS的造模方法。

本实验以MR SWI序列为标准统计SS-CNS的阳性率为44%(11/25)，低于文献报道的SWI显示外伤患者96.9%的SS-CNS阳性率和动脉瘤破裂患者的54.2%的SS-CNS阳性率[7-8]。本次实验中注血量仅为1.0～1.5 mL(平均1.16 mL)，低于临床上患者的出血量，但加大注血量会增加实验兔的死亡率，降低实验的效率。因此，选择合适的注血量是实验中的一个关键因素，如何在保证实验的阳性率的情况下尽量降低兔的死亡率，尚需进一步研究。本研究中大体标本肉眼观察下SS-CNS的阳性率为44%(11/25)，略高于病理标本的阳性率40%(10/25)，在病理切片染色时，由于只能选择部分切片进行染色，可能存在部分病灶的遗漏，因此必须对照大体标本图像选取合适的取材层面，以免漏掉病灶；另一方面，仅凭肉眼观察存在假阳性的可能。本研究中饲养105天与饲养154天的新西兰兔，SS-CNS造模阳性率的差异无统计学意义，说明饲养时间对SS-CNS造模成功率的影响不大。

本次研究也存在一些局限性：CT及MRI机房由于设备需要所以温度较低，实验过程对兔保温不够，新西兰兔在麻醉过程中有部分死亡从而导致实验失败。由于穿刺后需要饲养时间较长，在饲养过程中也有新西兰兔死亡发生，可能与穿刺注血后仅仅单纯饲养观察，没有对精神状态差、食欲不佳的样本进行及时补充营养有关。因此，后续实验可以通过以下方式改善：麻醉穿刺时注意对新西兰兔保温，尽量保证室内温度适宜；穿刺后饲养时定期观察，及时对症处理等；对实验动物补充必要的营养成分。

综上所述，本研究通过颅骨直接钻孔单次注血法成功制作SS-CNS模型，并首次发现单次SAH动物模型会部分进展为SS-CNS。本实验不仅为SS-CNS提供了新的病因假说，而且为SS-CNS研究提供了一种合理的SAH建模方法，此方法较传统方法建立模型相比，具有操作相对简单、可重复性较高的优点，而且此实验模型可用于研究SS-CNS的发病机制及药物治疗效果的评价。