Th22、Treg细胞转录因子及细胞因子在子痫前期孕妇胎盘组织中的表达及意义

王连云　张琼　金栩冰　熊文栋　叶文　王繁

[摘要] 目的 通過检测子痫前期孕妇胎盘组织中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg细胞转录因子AHR、Foxp3及细胞因子IL-22、IL-10的表达，探讨其在子痫前期中的作用。 方法 选取35例明确诊断的子痫前期孕妇为研究组，同时选取正常妊娠孕妇35例为对照组，采用实时荧光定量PCR检测两组孕妇胎盘组织中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg细胞转录因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表达情况;采用免疫组化检测细胞因子IL-22、IL-10的表达。 结果 AHR mRNA在研究组和对照组的表达量分别为（1.85±0.47）和（0.89±0.26），Foxp3 mRNA在两组的表达量分别为（0.76±0.23）和（1.31±0.42），差异均具有统计学意义;IL-22在研究组和对照组的阳性表达率分别为68.57%和40.00%，IL-10在两组的表达率为34.29%和60.00%，差异也具有统计学意义。 结论 Th22、Treg细胞转录因子及细胞因子的异常表达，可能参与了子痫前期的发生。

[关键词] 子痫前期;Th22细胞;调节T细胞;转录因子;细胞因子

[中图分类号] R714.244          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）05-0038-04

Expression and significance of Th22， Treg cell transcription factors and cytokines in placenta tissue of preeclampsia pregnant women

WANG Lianyun  ZHANG Qiong  JIN Xubing  XIONG Wendong  YE Wen  WANG Fan

Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou  325027， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factors AHR， Foxp3， and cytokines IL-22 and IL-10 in the placenta of preeclampsia pregnant women， and to explore their role in preeclampsia. Methods Thirty-five definite pregnant women with preeclampsia were selected as the study group， while 35 normal pregnant women were selected as the control group. The Th22， CD4+CD25+CD127low Treg cell transcription factor AHR mRNA and Foxp3 mRNA expressions in placental tissues of two groups of pregnant women were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The cytokine IL-22 and IL-10 expressions were detected by immunohistochemical method. Results The expression levels of AHR mRNA in the study group and control group were（1.85±0.47） and （0.89±0.26）， respectively. The expression levels of Foxp3 mRNA in the two groups were （0.76±0.23） and （1.31±0.42）， and the differences were statistically significant. The positive expression rates of IL-22 in the study group and control group were 68.57% and 40.00%， respectively. The expression rates of IL-10 in the two groups were 34.29% and 60.00%， and the differences were also statistically significant. Conclusion The abnormal expression of Th22 and Treg cell transcription factors and cytokines may be involved in the occurrence of preeclampsia.

[Key words] Preeclampsia; Th22 cells; Regulatory T cells; Transcription factors; Cytokines

子痫前期（Preeclampsia，PE）是妊娠与血压升高并存的一种疾病，发生率约为5%左右，可致孕产妇多器官功能损害，严重者可导致子痫甚至孕产妇和围生儿的死亡，是造成孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一[1，2]。近年来，随着我国二胎政策的开放，高危妊娠产妇明显增多，子痫前期的发病率也呈逐渐升高趋势[3]。到目前为止，PE的病因及发病机制尚未完全阐明。近年来的研究初步表明免疫功能紊乱是PE发生的一个重要原因，PE孕妇往往存在炎症免疫过度的激活[4]。目前免疫因素的研究主要集中在Toll样受体家族、蜕膜自然杀伤细胞、巨噬细胞等方面，而子痫前期特异性免疫研究集中在T淋巴细胞，研究表明在PE孕妇中存在着T淋巴细胞的免疫异常[5]。本研究通过检测PE孕妇胎盘组织中Th22、CD4+CD25+CD127low Treg细胞转录因子AHR（芳香烃受体）、Foxp3（叉状头/翅膀状螺旋转录因子）mRNA及相关细胞因子IL-22、IL-10的表达情况，以探讨其在PE发生、发展过程中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2018年11月～2019年5月在我院定期产检、诊断、住院治疗直至分娩的PE孕妇35例为研究组;搜集同期在我院定期产检并住院分娩的正常妊娠孕妇，其孕周、年龄与研究组相近、产检无异常且随访至产后42 d亦无异常的健康孕妇35例为对照组。所有入选孕妇孕前均无内外科疾病，均为单胎妊娠，且无其他妊娠合并症及并发症。PE的诊断严格按照谢幸、孔北华、段涛主编《妇产科学》第9版的诊断标准进行诊断[6]。所有研究对象均签署知情同意书，且经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 取材方法  所有入组孕妇在胎盘娩出后立即采集胎盘组织：于胎盘中央母体面取大小约1 cm×1 cm×1 cm组织，避开出血、坏死、钙化区，使用生理盐水冲洗后，置入经DEPC处理的EP管中，转移至-80℃冰箱待统一检测。同法再取约1 cm×1 cm×1 cm 大小的胎盘组织，应用生理盐水充分漂洗，10%福尔马林液固定，石蜡包埋，连续4 μm切片，保存，待统一检测。

1.2.2 主要仪器和试剂  ABI7500 PCR系统及SYBRgreen I购自美国ABI公司;紫外分光光度计购自德国默克生物科技公司。总RNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司;免疫组化仪器购自美国罗氏公司;免疫组化实验试剂盒购自福建迈新生物技术开发有限公司。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测Th22、CD4+CD25+CD127low Treg细胞转录因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表达  采用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，采用紫外分光光度计，测定其在260 nm和280 nm的吸光度，计算RNA纯度，使RNA的纯度符合要求。利用琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，再将所得到的RNA按照反转录试剂盒说明逆转录成cDNA。对cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系：上、下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶10 μL，模板10 μL，双蒸水7.2 μL。PCR反应条件：95℃ 30 s，1个循环;95℃ 10 min，95℃ 15 s，;61℃ 1 min，共45个循环。采用ABI7500 PCR系统及SYBRgreen I染料法进行荧光定量PCR检测，采用β-actin 作为内参照。GenBank上查找目的基因mRNA序列，引物由Primer 5.0软件设计（表1），由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.4 免疫组化检测两组孕妇胎盘组织中细胞因子IL-22、IL-10 的表达  所有標本采用免疫组化检测IL-22和IL-10的表达，实验步骤严格按照仪器及试剂盒说明进行操作。IL-22和IL-10在胎盘组织中的阳性表达表现为细胞浆或细胞核内出现棕黄色颗粒。采用半定量评分法，400倍镜下任意观察5个视野。根据阳性细胞所占百分数及颜色的强度，分为①阴性（-）：0分;②弱阳性（+）：l～4分;③中等阳性（++）：5～8分;④强阳性（+++）：9～12分[7]。

1.3 观察指标

记录两组孕妇年龄、分娩孕周、收缩压、舒张压、尿蛋白及新生儿出生体重等情况;记录转录因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA在两组孕妇胎盘中的表达情况，其中基因表达采用2-ΔCT法比较，ΔCT=CT目的基因-CT内参基因;并记录两组孕妇细胞因子IL-22、IL-10在胎盘组织中的阳性表达情况。

1.4 统计学处理

运用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行处理，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验;计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇临床资料比较

研究组孕妇和对照组孕妇年龄、分娩孕周比较差异无统计学意义（P>0.05）;研究组孕妇收缩压、舒张压及尿蛋白较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;而研究组新生儿出生体重明显低于对照组，其差异亦具有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.2 两组孕妇胎盘组织中Th22、Treg细胞转录因子AHR mRNA、Foxp3 mRNA的表达水平比较

研究组孕妇胎盘组织中Th22细胞转录因子AHR mRNA的表达量为（1.85±0.47），对照组孕妇胎盘组织中的Th22细胞转录因子AHR mRNA的表达量为（0.89±0.26），两组相比差异有统计学意义（P<0.01）;而Treg细胞转录因子Foxp3 mRNA的表达量在研究组中明显低于对照组，差异也具有统计学意义（P<0.01）（表3）。

2.3 两组孕妇胎盘组织中细胞因子IL-22、IL-10的表达水平比较

本研究结果显示，IL-22在研究组孕妇胎盘组织中的阳性表达率为68.57%，明显高于其在对照组中的阳性表达率，差异有统计学意义（P<0.05）;IL-10在研究组孕妇胎盘组织中的阳性表达率低于对照组，差异亦具有统计学意义（P<0.05）（表4）。

3 讨论

妊娠被认为是一种成功的半同体移植，一次成功的妊娠需要母胎间免疫平衡的维持，这种免疫平衡的破坏是妊娠期高血压疾病发生的一个重要原因。临床观察发现，胎盘娩出后子痫前期的病情往往得到较快的缓解，因此，胎盘被认为是子痫前期发生的始发病灶。近年来的研究发现，T细胞在子痫前期孕妇中存在异常分化，致使子痫前期孕妇出现异常的T细胞免疫及其功能因子的异常分泌[8]，这可能是导致子痫前期发生的重要原因。

AHR属于异二聚体转录调控子的碱性螺旋-环-螺旋超家族中新发现的PAS亚家族中的一种，是一种配体激活转录因子，其表达于哺乳动物的肝脏、皮肤、肺、消化道、黏膜上皮细胞和胎盘等组织上[9-10]。在T细胞的分化过程中，通过AHR的作用，能使初始T细胞向Th22细胞分化，但这个过程受到其他细胞因子的影响：如IL-6、TNF-α可以促进Th22细胞的分化，而IL-10、转化生长因子-β等则会抑制Th22细胞的分化[11-12]。Th22细胞是最新发现的一群在功能和分化上独立的CD4+T淋巴细胞亚群，其能分泌特征性的功能因子IL-22。IL-22由活化后的T 细胞产生，Th17细胞、Th22 等均可能产生IL-22，但在所有分泌IL-22的T细胞亚群中，Th22细胞所占比例为37%～63%。Th22细胞分泌的IL-22与自身功能的发挥密切相关，Th22细胞主要是通过IL-22发挥功能[13-14]。目前的研究表明，Th22 细胞、IL-22在自身免疫性疾病、感染性疾病、炎症性肠病及恶性肿瘤中均发挥着重要的作用[15-17]。通过本研究发现，子痫前期孕妇胎盘组织中AHR mRNA异常高表达，IL-22亦异常高表达，提示Th22细胞在子痫前期孕妇中存在异常表达，这种免疫紊乱可能是子痫前期的发生原因，但是具体作用方式及作用机制尚需进一步研究发现。

Treg细胞是一类高表达CD4、CD25，低表达CD127，分泌IL-10和转化生长因子-β的细胞亚群，在抑制自身免疫性疾病、介导异体器官移植免疫耐受中发挥重要作用[18]，其能够在母胎界面直接调节免疫反应，叉状头/翅膀状螺旋转录因子（forkhead box protein-3，Foxp3）是Treg细胞的特异性标志，在Treg细胞发育和功能维持中起着重要作用[19]。Treg细胞分泌多种细胞因子，IL-10是其中一種。近年来研究显示子痫前期孕妇外周血中Treg细胞数量与正常妊娠者相比明显减少[20]，因此推测Foxp3 的表达下降可能与Treg细胞数量减少有关。本研究显示，Foxp3 mRNA在子痫前期孕妇胎盘中的表达较正常妊娠孕妇明显下降，这与范月莲等[21]研究结果一致，且我们的研究亦提示Treg细胞的细胞因子IL-10在胎盘中的表达亦明显下降，提示在子痫前期孕妇中存在Treg细胞的转录因子及细胞因子的表达失衡，考虑其参与子痫前期的发生。

综上所述，Th22细胞转录因子及细胞因子在子痫前期孕妇胎盘中高表达，而Treg细胞转录因子及细胞因子在子痫前期孕妇中低表达，提示Th22、Treg细胞在子痫前期孕妇中存在表达失衡与紊乱，这种免疫紊乱可能是子痫前期的发生原因，深入研究其变化规律及作用机制，对明确子痫前期的发生原因有重要意义。

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（收稿日期：2019-10-24）