槐耳醇提物的抗氧化降血糖活性

苏伟，陈盛芳，施昊卿，宋康馨，李超*

徐州工程学院食品工程学院（徐州 221018）

槐耳（Trametes robiniophila），多孔菌科多年卧孔菌属[1]，分布于河北、山东、陕西、江苏等地[2]。槐耳具有增强人体免疫功能[3]、抗肿瘤[4]和抗病毒[5]等多种功效。已有的文献报道多是关于槐耳多糖，而关于槐耳多酚功效的研究很少，为此，此次试验研究槐耳醇提物的抗氧化活性和降血糖活性，为扩大开发其食医药用功效提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

槐耳，安国市旭芳中药材经营有限公司；芦丁，上海如吉生物科技发展有限公司；儿茶素，中国药品生物制品检定所；TPTZ（2, 4, 6-三（2-吡啶基）三嗪），上海伊卡生物技术有限公司；ABTS（2, 2-联氮双（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐），合肥博美生物科技有限公司；p-DMACA（对二甲氨基肉桂醛），上海原叶生物科技有限公司；α-淀粉酶，美国Sigma-aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 设备与仪器

ZHBE-50型闪式提取器，河南智晶生物科技发展有限公司；L550型低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；7230G型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；LGJ-10型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；Synergy H1型全功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 槐耳醇提物的制备

原料→烘干（60℃）→粉碎→过筛（100目）→浸泡（60%乙醇，液料比8∶1 mL/g，12 h）→闪式提取（电压80 V，每次60 s，提取3次）→离心（4 000 r/min，20 min）→抽滤→浓缩（50℃）→冷冻干燥→槐耳醇提物粉

1.3.2 醇提物成分含量的测定

1.3.2.1 多酚含量测定

采用福林酚法[6]。将2.5 mL不同浓度没食子酸溶液、1 mL Folin-Ciocalteu试剂和3 mL的碳酸钠溶液（10 g/100 mL）混合，添加纯净水定容至25 mL，晃匀，30℃放置1.5 h，750 nm处测定吸光度。以没食子

酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.165 7x-0.000 4（R2=0.995 9）。

1.3.2.2 黄酮含量测定

采用NaNO2-Al3+-NaOH法[7]。将5.4 mL不同浓度芦丁溶液和3 mL亚硝酸钠溶液（5 g/100 mL）混合，晃匀，37℃下避光6 min；然后加入0.3 mL Al(NO3)3溶液（10 g/100 mL），晃匀，37℃下避光6 min；最后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液后定容至10 mL，晃匀，37℃下避光10 min，510 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.010 9x-0.009 4（R2=0.999 0）。

1.3.2.3 黄酮醇含量测定

采用氯化铝醋酸钠法[8]。将2.0 mL不同浓度芦丁溶液、2.0 mL AlCl3溶液（2 g/100 mL）和6 mL醋酸钠溶液（5 g/100 mL）混合，晃匀，20℃下避光反应2.5 h，440 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.022 6x- 0.001 8（R2=0.999 7）。

1.3.2.4 黄烷醇含量测定

采用p-DMACA盐酸法-儿茶素法[9]。将1.0 mL不同浓度儿茶素溶液和3 mLp-DMACA溶液混合，晃匀，37℃下避光反应20 min，640 nm处测定吸光度。以儿茶素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.085 5x+0.024 2（R2=0.996 3）。

1.3.2.5 酚酸含量测定

按参考文献[10]方法稍有修改。将2.0 mL不同浓度没食子酸溶液、800 μL SDS溶液（0.3 g/100 mL）、400 μL氯化铁（0.6 g/100 mL）和六氰合铁酸钾（0.9 g/100 mL）的混合液（按比例10∶9混合）混合，晃匀，室温下避光反应5 min，添加纯净水定容于10 mL，晃匀，室温下避光反应20 min，743 nm处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.563 3x+0.007 2（R2=0.996 4）。

1.3.3 抗氧化活性测定

1.3.3.1 铁离子还原抗氧化力试验

按参考文献[11]方法稍有修改。

1) FRAP试剂的配制：A液为10 mmol/L的TPTZ溶液；B液为20 mmol/L的FeCl3·6H2O溶液；C液为pH 3.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，按1∶1∶10体积比混合，配成FRAP工作液，现配现用。

2) FeSO4标准曲线绘制：分别吸取0，0.35，0.50，0.65，0.80，0.95和1.10 mL FeSO4·7H2O溶液（1.052 mg/mL）于试管中，添加纯净水定容至10 mL；再分别取0.3 mL的上述溶液和3.7 mL FRAP工作液混合，晃匀，37℃避光反应10 min，以空白组为参比，593 nm处测定吸光度。以FeSO4·7H2O毫摩尔浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.023 7x-0.001 6（R2=0.997 8）。

3) 试样的测定：将0.3 mL不同浓度槐耳醇提物溶液和3.7 mL的FRAP工作液于试管中混合，晃匀，37℃下避光10 min，以空白管为参比，593 nm处测其吸光度。VC作为阳性对照。

4) 评价：试样总抗氧化能力以FRAP值表示，即达到同样吸光度所需的FeSO4·7H2O溶液的摩尔浓度（μmol/L），FRAP值越大，抗氧化活性越强。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除试验

按参考文献[12]方法稍有修改。

1) ABTS+工作液的配制：A液为7 mmol/L ABTS溶液；B液为140 mmol/L K2S2O8溶液；将10 mL A液和176 μL B液混匀，室温避光过夜12～16 h，该溶液即为ABTS+储备液。将生成的ABTS+储备液用纯净水稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.850±0.050，即得ABTS+工作液。

2) 试样的测定：将1.0 mL不同浓度槐耳醇提物溶液和4 mL ABTS+工作液依次加入到试管，晃匀，37℃下避光反应60 min，734 nm处测定吸光度，记作Ai；采用纯净水代替槐耳醇提物溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ac；采用纯净水代替ABTS+工作液，重复上述过程，测定吸光度，记作Aj。测定上述3种吸光度，以纯净水作参比。清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

1.3.3.3 总还原力试验

按参考文献[13]方法稍有修改。将0.5 mL不同浓度槐耳醇提物溶液、1.25 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6，0.2 mol/L）和1.25 mL K3[Fe(CN)6]溶液（1 g/100 mL）依次加入到试管，晃匀，50℃避光反应20 min；添加1.25 mL三氯乙酸（10 g/100 mL）终止反应；3 000 r/min离心10 min；取上清液，添加4.25 mL纯净水和0.85 mL FeCl3溶液（0.1 g/100 mL），晃匀，700 nm处测定吸光度，记作Ai；采用纯净水代替试样溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ac；A还原力=Ai-Ac。用纯净水作为参比，用VC作为阳性对照。A还原力越大，还原力越强，抗氧化活性越强。

1.3.3.4 总抗氧化试验

按参考文献[14]方法稍有修改。A液为0.6 mol/L浓硫酸溶液；B液为28 mmol/L磷酸钠溶液；C液为4 mmol/L钼酸铵溶液；将A、B和C等体积混匀即得磷钼试剂。将1.0 mL不同浓度槐耳醇提物溶液和3.0 mL的磷钼试剂依次加入到试管，晃匀，95℃反应90 min，放冷至室温，695 nm处测定吸光度，记作Ai；采用纯净水代替试样溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ac；A总抗氧化=Ai-Ac。用纯净水作为参比，用VC作为阳性对照。A总抗氧化越大，还原力越强，抗氧化活性越强。

1.3.4 抑制α-淀粉酶活性测定

按参考文献[15]方法稍有修改。在10 mL容量瓶中依次添加0.7 mL不同浓度槐耳醇提物溶液和0.6 mL 1%可溶性玉米淀粉溶液；晃匀，37℃预热5 min；再加入0.2 mL 20 U/mLα-淀粉酶溶液（提前37℃预热5 min）；晃匀，37℃避光反应5 min；加入0.5 mL 1% DNS溶液，晃匀，100℃避光反应5 min，冷却，定容至10 mL，540 nm处测定吸光度，记作Ai；采用磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L，PBS）代替槐耳醇提物溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ac；采用PBS代替α-淀粉酶溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Aj；采用PBS代替α-淀粉酶溶液，重复上述过程，测定吸光度，记作Ad。以阿卡波糖为阳性对照，纯净水为参比。抑制率=[1-（Ai-Aj）/（Ac-Ad）]×100%。

1.4 数据分析

IC50值采用PASW Statistics 18.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 成分分析

槐耳醇提物的多酚含量为103.62 mg PE/g FDW，总黄酮含量为195.64 mg RE/g FDW，总黄酮醇含量为1.50 mg RE/g FDW，总黄烷醇含量为203.20 mg CE/g FDW，总酚酸含量为43.79 mg PE/g FDW。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 铁离子还原抗氧化力

由图1可知，FRAP值与槐耳醇提物浓度在1.8～ 16.2 μg/mL范围内呈正相关，随着浓度的增加，FRAP值也随之增加。在槐耳醇提物1.8 μg/mL时，有最小的FRAP值，为3.63；在16.2 μg/mL时，有最大的FRAP值，为32.00。当VC和槐耳醇提物取相同浓度时，VC有更高的FRAP值，说明VC的铁离子还原抗氧化力强于槐耳醇提物。

图1 铁离子还原抗氧化

2.2.2 ABTS+自由基清除

由图2可知，ABTS+自由基清除率与槐耳醇提物浓度在3～30 μg/mL范围内呈正相关，随着浓度的增加，清除率也随之增加。在槐耳醇提物3 μg/mL时，有最小的清除率（21.92%）；在30 μg/mL时，有最大的清除率（92.86%）。槐耳醇提物的IC50值为8.88 μg/mL；VC的IC50值为2.34 μg/mL，说明VC清除ABTS+自由基的能力强于槐耳醇提物。

图2 ABTS+自由基清除活性

2.2.3 总还原力

由图3可知，A还原力值与槐耳醇提物浓度在2～20 μg/mL范围内呈正相关，随着浓度的增加，A还原力也随之增加。在槐耳醇提物2 μg/mL时，有最小的A还原力，为0.202；在20 μg/mL时，有最大的A还原力，为0.540。当VC和槐耳醇提物取相同浓度时，VC有更高的A还原力，说明VC的总还原力强于槐耳醇提物。

图3 总还原力

2.2.4 总抗氧化

由图4可知，A总抗氧化值与槐耳醇提物浓度在15～ 150 μg/mL范围内呈正相关，随着浓度的增加，A总抗氧化也随之增加。在槐耳醇提物15 μg/mL时，有最小的A总抗氧化，为0.101；在150 μg/mL时，有最大的A总抗氧化，为0.862。当VC和槐耳醇提物取相同浓度时，VC有更高的A总抗氧化，说明VC的总抗氧化强于槐耳醇提物。

2.3 抑制α-淀粉酶活性分析

由图5可知，α-淀粉酶抑制率与槐耳醇提物浓度在0.28～2.24 mg/mL范围内呈正相关，随着浓度的增加，其对α-淀粉酶的抑制率也随之增加。在槐耳醇提物0.28 mg/mL时，有最小的抑制率，为44.87%；在2.24 mg/mL时，有最大抑制率，为93.87%。槐耳醇提物的IC50值为0.447 mg/mL，阿卡波糖的IC50值为2.76 mg/mL，说明槐耳醇提物抑制α-淀粉酶的能力比阿卡波糖强，有更高效的降血糖作用。

图4 总抗氧化

图5 抑制α-淀粉酶活性

3 结论

槐耳醇提物中多酚含量为103.62 mg PE/g FDW、黄酮含量为195.64 mg RE/g FDW、黄烷醇含量为203.2 mg CE/g FDW、黄酮醇含量为1.50 mg RE/g FDW、酚酸含量为43.79 mg PE/g FDW。抗氧化活性中，其铁离子还原抗氧化能力在1.8～16.2 μg/mL范围内FRAP值为3.63～32.00；清除ABTS+自由基能力在3～30 μg/mL范围内清除率为21.92%～92.86%；总还原力在2～20 μg/mL范围内A还原力为0.202～0.540；总抗氧化力在15～150 μg/mL范围内A总抗氧化为0.101～0.862，表明槐耳醇提物具有较强的抗氧化能力。通过抑制α-淀粉酶活性的强弱来表达其降血糖能力的大小，槐耳醇提物浓度在0.28～2.24 mg/mL范围内抑制率为44.87%～93.87%，IC50值为0.447 mg/mL，阿卡波糖的IC50值为2.76 mg/mL，表明槐耳醇提物抑制α-淀粉酶活性的能力更强，有更高效的降血糖作用。槐耳醇提物具有良好的抗氧化能力和高效的降血糖能力，可作为制备抗氧化保健品和降血糖药物的原料，有着广阔的开发利用空间和巨大的市场潜力。